实验十五消毒和灭菌一、实验目的和内容目的：了解消毒和灭菌的原理，并掌握各种灭菌方法的操作步骤。内容：1.高压蒸汽灭菌法2.干热灭菌法3.紫外线灭菌法二、实验材料和用具待灭菌的培养基和链霉素溶液。手提式高压蒸汽菌锅、电热烘箱、培养皿、试管、紫外线灯。三、 操作步骤（一）高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。1.加水首先将内层火菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角架相平为宜。切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干引起炸裂事故。2.装料将装料筒放回锅内，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3.加盖并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4.用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1MPa，121.5℃，20min灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维持所需压力。5，灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到“0”时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。37
37 实验十五 消毒和灭菌 一、 实验目的和内容 目的：了解消毒和灭菌的原理，并掌握各种灭菌方法的操作步骤。 内容：1. 高压蒸汽灭菌法 2. 干热灭菌法 3. 紫外线灭菌法 二、 实验材料和用具 待灭菌的培养基和链霉素溶液。 手提式高压蒸汽菌锅、电热烘箱、培养皿、试管、紫外线灯。 三、 操作步骤 （一）高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。 1. 加水 首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为 宜。 切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干引起炸裂事故。 2. 装料 将装料筒放回锅内，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通 而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。 3．加盖 并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧 相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。 4．用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的冷空气。待冷空气完全 排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时， 控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 0.1MPa，121.5℃，20min 灭菌。 灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽后，才能关上排气阀，维 持所需压力。 5．灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力 降至“0”时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到“0”时，打 开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试 管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者
6.将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。（二）干热灭菌法干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭菌。1．装入待灭菌物品将包好的待灭菌物品（培养血，试管，吸管等）放入电烘箱内，关好箱门。物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。2.升温接通电源，拔动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐渐上升。当温度升至100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停正加温，此时如过还未达到所需的160170℃温度，则需转动调节器使红灯再亮，如此反复调节，直至达到所需温度。3.恒温当温度升到160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度2h。干热灭菌过程中，严防恒温调节的自动控制失灵面造成安全事故。4.降温切断电源、自然降温。5.开箱取物待电烘箱内温度降到70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。电烘箱内温度未降到70°℃以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器血炸裂。（三）紫外线灭菌法紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物以不超过1.2m为宜。1.单用紫外线照射（1）在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射30min，将开关关闭。（2）将牛肉膏蛋白陈平板盖打开15min，然后盖上皿盖。置37℃培养24h。共做三套。（3）检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过4个，说明灭菌效果良好，否则，需延长照射时间或同时加强其他措施。2.化学消毒剂与紫外线照射结合使用（1）在无菌室内，先喷洒3%～5%的石炭酸溶液，再用紫外线灯照射15min。（2）无菌室内的桌面，凳子用2%～3%来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射15min。（3）检查灭菌效果[方法同“单用紫外线照射”（3)]。因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。38
38 6．将取出的灭菌培养基放入 37℃温箱培养 24 小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。 （二）干热灭菌法 干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭菌。 1. 装入待灭菌物品 将包好的待灭菌物品(培养皿，试管，吸管等)放入电烘箱内，关好箱 门。 物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通，灭菌物品不要接触电烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火。 2. 升温 接通电源，拨动开关，打开电烘箱排气孔，旋动恒温调节器至绿灯亮，让温度逐 渐上升。当温度升至 100℃时，关闭排气孔。在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内 停止加温，此时如过还未达到所需的 160～170℃温度，则需转动凋节器使红灯再亮，如此反复 调节，直至达到所需温度。 3. 恒温 当温度升到 160～170℃时，借恒温调节器的自动控制，保持此温度 2h。 干热灭菌过程中，严防恒温调节的自动控制失灵面造成安全事故。 4. 降温 切断电源、自然降温。 5. 开箱取物 待电烘箱内温度降到 70℃以下后，打开箱门，取出灭菌物品。 电烘箱内温度未降到 700 C 以前，切勿自行打开箱门，以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。 （三）紫外线灭菌法 紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、接种箱、手术室内的空气及物体表面的灭菌。紫 外线灯距照射物以不超过 1.2m 为宜。 1. 单用紫外线照射 （1）在无菌室内或在接种箱内打开紫外线灯开关，照射 30min，将开关关闭。 （2）将牛肉膏蛋白胨平板盖打开 15min，然后盖上皿盖。置 37℃培养 24h。共做三套。 （3）检查每个平板上生长的菌落数。如果不超过 4 个，说明灭菌效果良好，否则，需延长 照射时间或同时加强其他措施。 2. 化学消毒剂与紫外线照射结合使用 （1）在无菌室内，先喷洒 3％～5％的石炭酸溶液，再用紫外线灯照射 15min。 （2）无菌室内的桌面，凳子用 2％～3％来苏尔擦洗，再打开紫外线灯照射 15min。 （3）检查灭菌效果[方法同“单用紫外线照射”(3)]。 因紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯 光下工作
四、实验报告1.记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件。2.检查培养基灭菌是否彻底。五、问题和思考1.比较各种灭菌方法的原理及使用范围。2.高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降到0时才能打开排气阀，开盖取物？3.为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高、时间长?请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比较实验方案。4.细菌营养体和细菌芽孢对紫外线的抵抗力会一样吗?为什么？39
39 四、 实验报告 1. 记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件。 2. 检查培养基灭菌是否彻底。 五、 问题和思考 1. 比较各种灭菌方法的原理及使用范围。 2. 高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降 到 0 时才能打开排气阀，开盖取物？ 3. 为什么干热灭菌比湿热灭菌所需要的温度高、时间长?请设计干热灭菌和湿热灭菌效果比 较实验方案。 4. 细菌营养体和细菌芽孢对紫外线的抵抗力会一样吗?为什么?