实验十三平板菌落计数法一、实验目的和内容目的：掌握平板菌落计数的基本原理和方法。内容：平板菌落计数二、实验材料和用具大肠杆菌（E.coli）菌悬液牛肉膏蛋白陈培养基、1ml无菌吸管、无菌平皿、盛有4.5ml无菌水的试管、试管架、记号笔、恒温培养箱等。三、操作步骤1.编号取无菌平皿9套，分别用记号笔标明10、10°、10°（稀释度）各3套。另取6支盛有4.5ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10″、10、10″、10″、10°、10″。2.稀释用1ml无菌吸管吸取1ml已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放0.5ml至10″的试管中，此即为10倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。将10试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支1ml吸管插入10°试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快。吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取吸10″菌液1ml，精确地放0.5m1至10试管中，此即为100倍稀释。.其余依次类推。整个稀释过程如图13-1所示。放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差较大。3.取样用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10、10、10的稀释菌悬液各1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每个平血放0.2ml。4.倒平板，尽快向上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中倒入融化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白陈培养基约10一15ml1/平皿，置水平位置迅速旋动，使培养基与菌液混合均匀，而又不使培养基荡出平皿或溅到平血盖上。由于细菌易吸附到玻璃器血表面，所以菌液加入到培养血后，应尽快倒入融化并冷却至45℃左右的培养基：立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。待培养基凝固后，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养30
30 实验十三 平板菌落计数法 一、 实验目的和内容 目的：掌握平板菌落计数的基本原理和方法。 内容：平板菌落计数 二、 实验材料和用具 大肠杆菌（E.coli）菌悬液 牛肉膏蛋白胨培养基、1ml 无菌吸管、无菌平皿、盛有 4.5ml 无菌水的试管、试管架、记号 笔、恒温培养箱等。 三、 操作步骤 1．编号 取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明 10-4、10-5、10-6（稀释度）各 3 套。另取 6 支盛有 4．5ml 无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 。 2．稀释 用 1ml 无菌吸管吸取 1ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放 0．5ml 至 10-1的试管中，此即为 10 倍稀释。将多余的菌液放回原菌液中。 将 10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。另取一支 1ml 吸管插入 10-1试管中来回 吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。吹吸菌液时不要太猛太快。吸时吸管伸入管底，吹 时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。用此吸管吸取吸 10-1菌液 1ml ， 精确地放 0．5ml 至 10-2试管中，此即为 100 倍稀释。.其余依次类推。整个稀释过程如图 13-1 所示。 放菌液时吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接触一个稀释度的菌悬液，否则稀释不精确，结果误差 较大。 3．取样 用 3 支 1ml 无菌吸管分别精确地吸取 10-4、10-5、10-6的稀释菌悬液各 1ml，对号 放入编好号的无菌培养皿中，每个平皿放 0.2ml。 4．倒平板 尽快向上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中倒入融化后冷却至 45℃左右的牛肉 膏蛋白胨培养基约 10―15ml/平皿，置水平位置迅速旋动，使培养基与菌液混合均匀，而又不使 培养基荡出平皿或溅到平皿盖上。 由于细菌易吸附到玻璃器皿表面，所以菌液加入到培养皿后，应尽快倒入融化并冷却至 45℃左右的培养基， 立即摇匀，否则细菌将不易分散或长成的菌落连在一起，影响计数。 待培养基凝固后，将平板倒置于 37℃恒温培养箱中培养
0.5ml0.5ml0.5ml0.5tml0.5ml0.5ml.2ml0.2ml4.5m101010-美原液10910-5-1010~15ml1111（熔化并冷却至45C培养基）图13-1平板菌落计数操作步骤5.计数培养48小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5一般选择每个平板上长有30~300个菌落的稀释度计算每毫升的含菌数较为合适。同一稀释度的三个重复对照的菌落数不能相差很悬殊，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由10"、10°、10三个稀释度计算出的每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般以三个连续稀释度中的第二稀释度倒平板培养后所出现的平均菌落数在50个左右为最好，否则要适当增加或减少稀释度加以调整。平板菌蓓计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可用涂布平板的方法进行。二者操作基本相同，所不同的是涂布平板法是先将牛肉育蛋白陈培养基融化后倒平板，待凝固后编号，并手37℃左右的温箱中烘烤30分钟，或在超净工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取0.1m菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20~30分钟，使菌液渗透入培养基表层内，然后再倒置于37℃的恒温箱中培养24~28h涂布平板用的菌悬液量一般以0.1ml较为适宜，如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布31
31 图 13-1 平板菌落计数操作步骤 5．计数 培养 48 小时后，取出培养皿，算出同一稀释度三个平皿上的菌落平均数，并按下 列公式进行计算： 每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀释度三次重复的菌落平均数×稀释倍数×5 一般选择每个平板上长有 30~300 个菌落的稀释度计算每毫升的含菌数较为合适。同一稀释 度的三个重复对照的菌落数不能相差很悬殊，否则表示试验不精确。实际工作中同一稀释度重复 对照平板不能少于三个，这样便于数据统计，减少误差。由 10-4、10-5、10-6三个稀释度计算出的 每毫升菌液中菌落形成单位数也不应相差太大。 平板菌落计数法，所选择倒平板的稀释度是很重要的，一般以三个连续稀释度中的第二稀释 度倒平板培养后所出现的平均菌落数在 50 个左右为最好，否则要适当增加或减少稀释度加以调 整。 平板菌蓓计数法的操作除上述倾注倒平板的方式以外，还可用涂布平板的方法进行。二者操 作基本相同，所不同的是涂布平板法是先将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，待凝固后编号， 并于 37℃左右的温箱中烘烤 30 分钟，或在超净工作台上适当吹干，然后用无菌吸管吸取 0．1ml 菌液对号接种于不同稀释度编号的平板上，并尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平 放于实验台上 20~30 分钟，使菌液渗透入培养基表层内，然后再倒置于 37℃的恒温箱中培养 24~28h。 涂布平板用的菌悬液量一般以 0.1ml 较为适宜，如果过少，菌液不易涂布开；过多则在涂布
完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。已经有菌落计数器可以自动对于培养基上菌落进行自动计数。如下图所示：图13-2我国数字显示式自动细菌检验仪器图13-3美国进口全自动影像分析菌落计数仪感应压力计数系统，快速精确，使用简便。3位数字LED显示，可计数0-999，每一次计数32
32 完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落。 已经有菌落计数器可以自动对于培养基上菌落进行自动计数。如下图所示： 图 13-2 我国数字显示式自动细菌检验仪器 图 13-3 美 国 进 口 全 自 动 影 像 分 析 菌 落 计 数 仪 感应压力计数系统，快速精确，使用简便 。3 位数字 LED 显示，可计数 0-999，每一次计数
均有语音提示（中英文可选），避免漏数和重复计数。可选明暗背景，无眩目背光，便于观察培养皿，操作不易疲劳。可放置直径50-90mm培养皿。放大镜放大倍数可变，可用于计数小菌落。可弯曲的支臂连接放大镜，可清楚地观察培养血。四、实验报告将培养后菌落计数结果填入下表：10′10*10*稀释度平均2平均平均32cfu数/平板每毫升中的cfu数五、问题和思考1．为什么融化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？2.要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？3.试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。33
33 均有语音提示（中英文可选），避免漏数和重复计数 。可选明暗背景，无眩目背光，便于观察培 养皿，操作不易疲劳 。可放置直径 50-90mm 培养皿 。放大镜放大倍数可变，可用于计数小菌落。 可弯曲的支臂连接放大镜，可清楚地观察培养皿 。 四、 实验报告 将培养后菌落计数结果填入下表： 10-4 10-5 10-6 稀释度 1 2 3 平均 1 2 3 平均 1 2 3 平均 cfu 数/平板 每毫升中的 cfu 数 五、 问题和思考 1. 为什么融化后的培养基要冷却至 45℃左右才能倒平板？ 2. 要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？ 3. 试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点