实验二十六细菌质粒DNA的小量制备一、实验目的和内容目的：学习和掌握碱裂解法小量制备质粒DNA的原理、方法和技术。内容：碱裂解法提取质粒DNA。二、实验材料和用具大肠杆菌TGI/pUC18（Ampr）。含氨芋青霉素（Amp）的LB液体和固体培养基、溶液IⅡIIⅢ和V、TE缓冲液、10μg/ml的无DNase的RNase、100%冷乙醇、电泳缓冲液（TAE缓冲液）、0.7%琼脂糖凝胶、凝胶加样缓冲液、1mg/ml溴化乙锭、氨苄青霉素水溶液（100μg/ml）、稳压电泳仪和水平式微型电泳槽、透射式紫外分析仪、旋涡混合器、微量加样器等。三、操作步骤1挑取大肠杆菌TGI/pUC18的一个单菌落于盛5mlLB培养基的试管中（含100μg/ml的氨苄青霉素），37℃振荡培养过夜（约16~24小时）。2.吸取1.5ml的过夜培养物于一小塑料离心管（又称Eppendorf管）中，离心（12000r/min,30s）后，弃去上清，留下细胞沉淀。离心可在4℃或室温（25℃~28℃）下进行，离心时间不可太长，以免影响下一步菌体的分散悬浮。3.加入100μ1冰预冷的溶液I，在旋涡混合器上强烈振荡混匀。要确保细胞被完全悬浮，使细胞最大数量地接触下一步的溶液Ⅱ，达到完全裂解，以提高质粒的产量。4.加入200μ1溶液Ⅱ，盖严管盖，反复颠倒小离心管5~6次或用手指弹动小管数次，以混合内容物。置冰溶中3~5分钟（根据不同菌株，可适当缩短）。注意不要强烈振荡，以免染色体DNA断裂成小的片段而不易与质粒DNA分开5.加入150μ1溶液Ⅲ，在旋涡混合器上快速短时（约2秒）振荡混匀，或将管盖朝下温和振荡10秒，置冰溶3~5分钟。确保完全混匀，又不致使染色体DNA断裂成小片段。6.离心（12000r/min）5min，以沉淀细胞碎片和染色体DNA。取上清转移至另一洁净的小离心管中。7.加入等体积的溶液IV，振荡混匀，室温下离心2分钟，小心吸取上层水相至另一洁净小离心管中，注意勿将两夜相中间的白色蛋白薄层吸出。67
67 实验二十六 细菌质粒 DNA 的小量制备 一、 实验目的和内容 目的：学习和掌握碱裂解法小量制备质粒 DNA 的原理、方法和技术。 内容：碱裂解法提取质粒 DNA。 二、 实验材料和用具 大肠杆菌 TGI/pUC18（Ampr）。 含氨苄青霉素（Amp）的 LB 液体和固体培养基、溶液Ⅰ Ⅱ Ⅲ和Ⅳ、TE 缓冲液、10μg/ml 的无 DNase 的 RNase、100%冷乙醇、电泳缓冲液（TAE 缓冲液）、0.7%琼脂糖凝胶、凝胶加样缓冲 液、1mg/ml 溴化乙锭、氨苄青霉素水溶液（100μg/ml）、稳压电泳仪和水平式微型电泳槽、透 射式紫外分析仪、旋涡混合器、微量加样器等。 三、 操作步骤 1. 挑取大肠杆菌 TGI/ pUC 18 的一个单菌落于盛 5ml LB 培养基的试管中（含 100μg/ml 的氨苄青霉素），37℃振荡培养过夜（约 16~24 小时）。 2. 吸取 1.5ml 的过夜培养物于一小塑料离心管（又称 Eppendorf 管）中，离心（12 000r/min,30s）后，弃去上清，留下细胞沉淀。 离心可在 4℃或室温（25℃~28℃）下进行，离心时间不可太长，以免影响下一步菌体的分散悬浮。 3. 加入 100μl 冰预冷的溶液Ⅰ，在旋涡混合器上强烈振荡混匀。 要确保细胞被完全悬浮，使细胞最大数量地接触下一步的溶液Ⅱ，达到完全裂解，以提高质粒的产量。 4. 加入 200μl 溶液Ⅱ，盖严管盖，反复颠倒小离心管 5~6 次或用手指弹动小管数次，以混 合内容物。置冰溶中 3~5 分钟（根据不同菌株，可适当缩短）。 注意不要强烈振荡，以免染色体 DNA 断裂成小的片段而不易与质粒 DNA 分开。 5. 加入 150μl 溶液Ⅲ，在旋涡混合器上快速短时（约 2 秒）振荡混匀，或将管盖朝下温和 振荡 10 秒，置冰溶 3~5 分钟。 确保完全混匀，又不致使染色体 DNA 断裂成小片段。 6. 离心（12 000 r/min）5min，以沉淀细胞碎片和染色体 DNA。取上清转移至另一洁净的 小离心管中。 7. 加入等体积的溶液Ⅳ，振荡混匀，室温下离心 2 分钟，小心吸取上层水相至另一洁净小 离心管中，注意勿将两夜相中间的白色蛋白薄层吸出
8.加入2倍体积的冷无水乙醇，置室温下2分钟，以沉淀核酸。9.室温下离心5分钟，弃上清。加入1ml70%乙醇振荡漂洗沉淀。10.离心后，弃上清。可见DNA沉淀附在离心管管壁上，用记号笔标记其位置，并用消毒的滤纸小条小心吸净管壁上残留的乙醇，将管倒置放在滤纸上，室温下蒸发痕量乙醇10~15分钟，或真空抽干乙醇2分钟。也可在65℃烘箱中干燥2分钟。11.加入50μ1TE缓冲液（含RNase，20μg/ml），充分混匀，取5μ1进行琼脂糖凝胶电泳，剩下的贮存於-20℃冰箱内备用，可长期保存。用加入的50u1TE缓冲液多次、反复地洗涤DNA沉淀标记部位，以充分溶解附在管壁上的质粒DNA。12.琼脂糖凝胶电泳观察质粒DNA。（1）将微型电泳槽的胶板二端档板插上，在其一端放好梳子，在梳子的底部与电泳槽底板之间保持约0.5mm的距离。（2）用电泳缓冲液配制0.7%的琼脂糖胶，加热使完全溶化，加入一小滴溴化乙锭溶液（1mg/ml），使胶呈微红色，摇匀（但不要产生气泡），冷至65℃左右，倒胶（凝胶一般为0.3~0.5cm）。倒胶之前先用琼脂糖封好电泳胶板二端挡板与其底板的连接处，以免漏胶（图26-1，A)。梳子琼脂糖挡板或胶带A电泳仪正极鱼板电冰缓冲液琼脂糖凝胶c图26-1琼脂糖凝胶电泳根据实验需要，漠化乙锭也可不直接加入胶中，而是在电泳完毕后，将凝胶放在含0.5mg/ml的EB中染色15-30分钟，然后转入蒸馏水中脱色15~30分钟。68
68 8. 加入 2 倍体积的冷无水乙醇，置室温下 2 分钟，以沉淀核酸。 9. 室温下离心 5 分钟，弃上清。加入 1ml 70%乙醇振荡漂洗沉淀。 10. 离心后，弃上清。可见 DNA 沉淀附在离心管管壁上，用记号笔标记其位置，并用消毒的 滤纸小条小心吸净管壁上残留的乙醇，将管倒置放在滤纸上，室温下蒸发痕量乙醇 10~15 分钟， 或真空抽干乙醇 2 分钟。也可在 65℃烘箱中干燥 2 分钟。 11. 加入 50μl TE 缓冲液（含 RNase，20μg/ml），充分混匀，取 5μl 进行琼脂糖凝胶电 泳，剩下的贮存於-20℃冰箱内备用，可长期保存。 用加入的 50μl TE 缓冲液多次、反复地洗涤 DNA 沉淀标记部位，以充分溶解附在管壁上的质粒 DNA。 12. 琼脂糖凝胶电泳观察质粒 DNA。 （1）将微型电泳槽的胶板二端档板插上，在其一端放好梳子，在梳子的底部与电泳槽底板 之间保持约 0.5mm 的距离。 （2）用电泳缓冲液配制 0.7%的琼脂糖胶，加热使完全溶化，加入一小滴溴化乙锭溶液 （1mg/ml），使胶呈微红色，摇匀（但不要产生气泡），冷至 65℃左右，倒胶（凝胶一般为 0.3~0.5cm）。倒胶之前先用琼脂糖封好电泳胶板二端挡板与其底板的连接处，以免漏胶（图 26-1， A）。 图 26-1 琼脂糖凝胶电泳 根据实验需要，溴化乙锭也可不直接加入胶中，而是在电泳完毕后，将凝胶放在含 0.5mg/ml 的 EB 中染色 15~30 分钟，然后转入蒸馏水中脱色 15~30 分钟
（3）待胶完全凝固后，小心取出二端挡板和梳子，将载有凝胶的电泳胶板（或直接将凝胶放入电泳槽的平台上，加电泳缓冲液，使其刚好浸没胶面（液面约高出胶面1mm）。（4）取上述获得的质粒DNA3~5μ1加1~2u1加样缓冲液（内含溴酚蓝指示剂），混匀后上样（图26-1，B）。（5）接通电源，记住：上样槽一端位於负极，电压降选择为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算），（图26-1，C)。（6）根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶，置紫外透射仪上观察结果或拍照。EB特异性地插入质粒DNA分子后，因为同一种质粒的相对分子质量大小一致，因此在凝胶中形成一条整齐的荧光带而有别于染色体荧光带。四、实验报告描绘出（或照像）3你在紫外透射仪上观察到的质粒凝胶电泳的结果。五、问题和思考1.试分析下列实验结果产生的可能原因，指出哪一种是正确结果？（1）没有观察到任何荧光带。（2）观察到2~3条整齐的荧光带。（3）只观察到一片不成带型的“拖尾”荧光。（4）三种类型核酸（染色体DNA、质粒DNA和RNA）均观察到。2.如果只需要检测（而不是分离制备）某大肠杆菌菌株是否含有质粒（或重组质粒），你能否在本实验的基础上提出一种（或多种）更为简便，迅速的方法设想？提示：（1）可否将有些溶液（或成分）合并成一种溶液而减少操作步骤？（2）作为检测某菌是否含有质粒，是否一定要将其染色体DNA、RNA去除干净？附注溶液IIⅡⅢIV的作用机理：溶液I中的葡萄糖是为了增加溶液粘度，以防止染色体DNA受机械剪切力作用而降解，污染质粒；溶菌酶（可省略）可水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖中的β-1，4糖苷键，因而具有溶菌作用；EDTA有二个作用：一是抑制DNaSe对DNA的降解作用，因为EDTA是一种金属离子整合剂，而DNase作用时需要一定的金属离子（如Mg等）做辅基：二是保证溶菌酶有一个良好的低离子强度的环境。溶液II中的NaOH可促使染色体DNA和质粒DNA强碱变性，SDS是离子型活性剂，其功能是溶解细胞膜上的脂肪与蛋白质，破坏细胞膜，解聚核蛋白以形成蛋白质变性复69
69 （3）待胶完全凝固后，小心取出二端挡板和梳子，将载有凝胶的电泳胶板（或直接将凝胶） 放入电泳槽的平台上，加电泳缓冲液，使其刚好浸没胶面（液面约高出胶面 1mm）。 （4）取上述获得的质粒 DNA 3~5μl 加 1~2μl 加样缓冲液（内含溴酚蓝指示剂），混匀后 上样（图 26-1，B）。 （5）接通电源，记住：上样槽一端位於负极，电压降选择为 1~5V/cm（长度以两个电极之 间的距离计算），（图 26-1，C）。 （6）根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶，置紫外透射 仪上观察结果或拍照。 EB 特异性地插入质粒 DNA 分子后，因为同一种质粒的相对分子质量大小一致，因此在凝胶中形成一条整齐 的荧光带而有别于染色体荧光带。 四、 实验报告 描绘出（或照像）3 你在紫外透射仪上观察到的质粒凝胶电泳的结果。 五、 问题和思考 1. 试分析下列实验结果产生的可能原因，指出哪一种是正确结果？ （1）没有观察到任何荧光带。 （2）观察到 2~3 条整齐的荧光带。 （3）只观察到一片不成带型的“拖尾”荧光。 （4）三种类型核酸（染色体 DNA、质粒 DNA 和 RNA）均观察到。 2. 如果只需要检测（而不是分离制备）某大肠杆菌菌株是否含有质粒（或重组质粒），你能 否在本实验的基础上提出一种（或多种）更为简便，迅速的方法设想？ 提示： （1）可否将有些溶液（或成分）合并成一种溶液而减少操作步骤？ （2）作为检测某菌是否含有质粒，是否一定要将其染色体 DNA、RNA 去除干净？ 附注 溶液Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ的作用机理： 溶液Ⅰ中的葡萄糖是为了增加溶液粘度，以防止染色体 DNA 受机械剪切力作用而降解，污染 质粒；溶菌酶（可省略）可水解菌体细胞壁的主要化学成份肽聚糖中的β-1，4 糖苷键，因而具 有溶菌作用；EDTA 有二个作用：一是抑制 DNase 对 DNA 的降解作用，因为 EDTA 是一种金属离子 鳌合剂，而 DNase 作用时需要一定的金属离子（如 Mg2+等）做辅基；二是保证溶菌酶有一个良好 的低离子强度的环境。溶液Ⅱ中的 NaOH 可促使染色体 DNA 和质粒 DNA 强碱变性，SDS 是离子型 活性剂，其功能是溶解细胞膜上的脂肪与蛋白质，破坏细胞膜，解聚核蛋白以形成蛋白质变性复
合物以利于沉淀。溶液IⅢI实际上是KAc-HAc缓冲液，其功能是使变性的质粒DNA复性并稳定地存在于溶液中。溶液IV中的酚和氯仿则是用来抽提DNA溶液中的蛋白质，加少量的异戊醇是为了减少抽提过程中的泡沫产生，以防止气泡阻止相互间的作用，同时也有助于分相（使上层水相，中层变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定）。70
70 合物以利于沉淀。溶液Ⅲ实际上是 KAc-HAc 缓冲液，其功能是使变性的质粒 DNA 复性并稳定地存 在于溶液中。溶液Ⅳ中的酚和氯仿则是用来抽提 DNA 溶液中的蛋白质，加少量的异戊醇是为了减 少抽提过程中的泡沫产生，以防止气泡阻止相互间的作用，同时也有助于分相（使上层水相，中 层变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定）