实验六鞭毛染色法及活细菌运动性的观察一、实验目的和内容目的：了解细菌鞭毛染色的原理，初步掌握鞭毛染色法；学习观察细菌运动的方法。内容：1.细菌的鞭毛染色法2.用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。二、实验材料和用具普通变形菌（(Proteusvulgaris)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）。硝酸银鞭毛染色液、0.01%美蓝水溶液、香柏油、二甲苯、无菌水、凡士林，显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、凹载玻片、盖玻片、镊子、细玻棒、吸水纸。三、操作步骤（一）细菌鞭毛染色1.菌种的准备要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌种，通常要连续移种1~2次，然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种：a.取新配制的营养琼脂斜面（表面较湿润、基部有冷凝水）接种，28~32℃培养10~14h，取斜面和冷凝水交接处培养物作染色观察材料：b.取新制备的营养琼脂（含0.8~1.0%的琼脂）平板，用接种环将新菌种点种于平板中央，28~32℃培养18~30h，让菌种扩散生长，取菌落边缘的菌苔（不要取菌落中央的菌苔）作染色观察的菌种材料。良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色的菌种材料因为老龄细菌鞭毛容易脱落。2.载玻片的准备将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20min，取出用清水充分洗净，沥干水后置95%乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。3.菌液的制备取斜面或平板菌种培养物数环于盛有1~2ml无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。挑菌时，尽可能不带培养基。4.制片取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水纸吸去玻片下端多余菌液，室温（或37℃温室）自然干燥。干后应尽快染色，不宜放置时间过长。5.染色涂片干燥后，滴加硝酸银染色A液覆盖3~5min，用蒸馏水充分洗去A液。用B液15
15 实验 六 鞭毛染色法及活细菌运动性的观察 一、 实验目的和内容 目的：了解细菌鞭毛染色的原理，初步掌握鞭毛染色法；学习观察细菌运动的方法。 内容：1. 细菌的鞭毛染色法 2. 用压滴法和悬滴法观察细菌的运动性。 二、 实验材料和用具 普通变形菌(Proteus vulgaris)、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。 硝酸银鞭毛染色液、0.01%美蓝水溶液、香柏油、二甲苯、无菌水、凡士林。 显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、凹载玻片、盖玻片、镊子、细玻棒、吸水纸。 三、 操作步骤 （一）细菌鞭毛染色 1. 菌种的准备 要求用活跃生长期菌种作鞭毛染色和运动性的观察。对于冰箱保存的菌种， 通常要连续移种 1~2 次，然后可选用下列方法接种培养作染色用菌种：a.取新配制的营养琼脂斜 面（表面较湿润、基部有冷凝水）接种，28~32℃培养 10~14h，取斜面和冷凝水交接处培养物作 染色观察材料；b. 取新制备的营养琼脂（含 0.8~1.0%的琼脂）平板，用接种环将新菌种点种于 平板中央，28~32℃培养 18~30h，让菌种扩散生长，取菌落边缘的菌苔（不要取菌落中央的菌苔） 作染色观察的菌种材料。 良好的培养物，是鞭毛染色成功的基本条件，不宜用已形成芽孢或衰亡期培养物作鞭毛染色的菌种材料， 因为老龄细菌鞭毛容易脱落。 2. 载玻片的准备 将载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约 20min，取出用清水充分洗净， 沥干水后置 95%乙醇中，用时取出在火焰上烧去酒精及可能残留的油迹。 3. 菌液的制备 取斜面或平板菌种培养物数环于盛有 1~2ml 无菌水的试管中，制成轻度混 浊的菌悬液用于制片。也可用培养物直接制片，但效果往往不如先制备菌液。 挑菌时，尽可能不带培养基。 4. 制片 取一滴菌液于载玻片的一端，然后将玻片倾斜，使菌液缓缓流向另一端，用吸水 纸吸去玻片下端多余菌液，室温（或 37℃温室）自然干燥。 干后应尽快染色，不宜放置时间过长。 5. 染色 涂片干燥后，滴加硝酸银染色 A 液覆盖 3~5min，用蒸馏水充分洗去 A 液。用 B 液
冲去残水后，再加B液覆盖涂片染色约数秒至1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲洗。若加B液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗。自然干燥。配制合格的染色剂（尤其是B液）、充分洗去A液再加B液、掌握好B液的染色时间均是鞭毛染色成败的重要环节。6．镜检千后用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的一定部位观察到鞭毛。菌体呈深褐色，鞭毛显褐色、通常呈波浪形。（二）细菌运动性的观察玻片的准备、菌种材料的准备同鞭毛染色法。1.压滴片（1）制片在洁净载玻片上加一滴无菌水，挑取一环菌液与水混合，再加一环0.01%的美蓝水溶液与其混合均匀。用镊子取一洁净盖玻片，使其一边于菌液边缘接触，然后将盖玻片慢慢放下盖在菌液上。观察专性好氧菌时，可在放盖玻片是压入小气泡，以防止细菌因缺氧而停止运动。（2）镜检先用低倍镜找到标本，再用高倍镜观察。也可用油镜观察，用油镜时，盖玻片厚度不能超过0.17mm。观察时，要用略暗光线。有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个细菌之间出现明显的位移而与布朗运动或随水流动相区别。2.悬滴法（图6-1）凡士林凹推菌液O盖玻片凹玻片2A菌液凡士林P盖玻片首液凹玻片34图6-1悬滴法制片的步骤16
16 冲去残水后，再加 B 液覆盖涂片染色约数秒至 1min，当涂面出现明显褐色时，立即用蒸馏水冲 洗。若加 B 液后显色较慢，可用微火加热，直至显褐色时立即水洗。自然干燥。 配制合格的染色剂（尤其是 B 液）、充分洗去 A 液再加 B 液、掌握好 B 液的染色时间均是鞭毛染色成败的重 要环节。 6. 镜检 干后用油镜观察。观察时，可从玻片的一端逐渐移至另一端，有时只在涂片的一 定部位观察到鞭毛。 菌体呈深褐色，鞭毛显褐色、通常呈波浪形。 （二）细菌运动性的观察 玻片的准备、菌种材料的准备同鞭毛染色法。 1. 压滴片 （1）制片 在洁净载玻片上加一滴无菌水，挑取一环菌液与水混合，再加一环 0.01%的美 蓝水溶液与其混合均匀。用镊子取一洁净盖玻片，使其一边于菌液边缘接触，然后将盖玻片慢慢 放下盖在菌液上。观察专性好氧菌时，可在放盖玻片是压入小气泡，以防止细菌因缺氧而停止运 动。 （2）镜检 先用低倍镜找到标本，再用高倍镜观察。也可用油镜观察，用油镜时，盖玻片 厚度不能超过 0.17mm。观察时，要用略暗光线。 有鞭毛细菌可作直线、波浪式或翻滚运动，两个细菌之间出现明显的位移而与布朗运动或随 水流动相区别。 2. 悬滴法（图 6-1） 图 6-1 悬滴法制片的步骤
（1）涂凡士林取洁净凹载玻片，在其四周涂少许凡士林。（图6-1.1）（2）加菌液在盖玻片中央滴一小滴菌液。为便于观察时寻找菌液位置，可用记号笔在菌液周围画上记号。菌液不能加得太多，为了便于观察，也可用接种环挑取一环菌液于盖玻片中央（图6-1.2)。（3）盖凹玻片将凹玻片的凹槽对准盖玻片中心的菌液，并轻轻盖在盖玻片上。轻轻按压使盖玻片与凹玻片粘合在一起，把液滴封闭在小室中。翻转凹玻片，使菌液滴悬在盖玻片下并位于凹槽中央（图6-1.3，4）。若菌液加得过多，此时菌液就会流到凹玻片上而影响观察（4）镜检先用低倍镜找到标本，并将液滴移至视野中央，然后用高倍镜观察。若用油镜观察，盖玻片厚度不能超过0.17mm，并要十分细心，以免压碎盖玻片、损坏镜头。观察过程要在略暗光线下进行。四、注意事项1．鞭毛染色液最好当日配置，次日使用则鞭毛染色浅，观察效果差。染色时一定要充分洗净A液后再加B液，否则背景不清晰。2.观察细菌的运动，载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则会影响细菌的运动。有些细菌，温度太低时不能运动。五、实验报告你所观察的细菌是否都有鞭毛？是否都能运动？鞭毛一一运动有无相关性？绘图表示有鞭毛细菌的形态特征。六、问题和思考1.用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌是否具有鞭毛，要注意哪些环节？2.悬滴法中，为什么要涂凡士林？为什么加得菌液不能太多？如果发现显微镜视野内大量细菌向一个方向流动，你认为是什么原因造成的？17
17 （1）涂凡士林 取洁净凹载玻片，在其四周涂少许凡士林。（图 6-1.1） （2）加菌液 在盖玻片中央滴一小滴菌液。为便于观察时寻找菌液位置，可用记号笔在菌 液周围画上记号。菌液不能加得太多，为了便于观察，也可用接种环挑取一环菌液于盖玻片中央 （图 6-1.2）。 （3）盖凹玻片 将凹玻片的凹槽对准盖玻片中心的菌液，并轻轻盖在盖玻片上。轻轻按压 使盖玻片与凹玻片粘合在一起，把液滴封闭在小室中。翻转凹玻片，使菌液滴悬在盖玻片下并位 于凹槽中央（图 6-1.3，4）。 若菌液加得过多，此时菌液就会流到凹玻片上而影响观察。 （4）镜检 先用低倍镜找到标本，并将液滴移至视野中央，然后用高倍镜观察。若用油镜 观察，盖玻片厚度不能超过 0.17mm，并要十分细心，以免压碎盖玻片、损坏镜头。 观察过程要在略暗光线下进行。 四、 注意事项 1. 鞭毛染色液最好当日配置，次日使用则鞭毛染色浅，观察效果差。染色时一定要充分洗 净 A 液后再加 B 液，否则背景不清晰。 2. 观察细菌的运动，载玻片和盖玻片都要洁净无油，否则会影响细菌的运动。有些细菌， 温度太低时不能运动。 五、 实验报告 你所观察的细菌是否都有鞭毛？是否都能运动？鞭毛——运动有无相关性？绘图表示有鞭 毛细菌的形态特征。 六、 问题和思考 1. 用鞭毛染色法准确鉴定一株细菌是否具有鞭毛，要注意哪些环节？ 2. 悬滴法中，为什么要涂凡士林？为什么加得菌液不能太多？如果发现显微镜视野内大量 细菌向一个方向流动，你认为是什么原因造成的？