实验五细菌芽抱、荚膜的染色及观祭一、实验目的和内容目的：掌握细菌的芽孢及荚膜染色方法。内容：1.细菌的芽孢染色。2.细菌的荚膜染色。二、实验材料和用具枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）、褐球固氮菌（Azotobacterchroococcum）的斜面菌种。二甲苯、香柏油、蒸馏水、5%孔雀水溶液、0.5%沙黄水溶液（或0.05%碱性复红）、绘图墨水（用滤纸过滤后备用）、1%结晶紫水溶液、20%硫酸铜水溶液。显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管（1X6.5cm）、烧杯（300mL）、滴管、试管夹、擦镜纸、吸水纸、木夹子。三、 操作步骤（一）芽孢染色法1.方法1——Schaeffer-Fulton氏染色法（1）制片取37℃培养18~24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。（2）染色加数滴孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒蒸气并开始计时，维持4~5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。（3）水洗倾去染液，待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。勿用瀑水对着菌膜冲洗，以免细菌被水冲掉。（4）复染用0.5%沙黄水溶液（或0.05%碱性复红）复燃1~2min。（5）水洗用缓流水洗后，吸干。（6）镜检制片干燥后，用油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。2.方法2——改良的Schaeffer-Fulton氏染色法（1）制备菌悬液加1~2滴水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2~3环培养18~24h的枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌悬液。所用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成芽孢囊为宜；取菌不宜太少。（2）染色加孔雀绿染液2~3滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合，然后将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色15~20min。13
13 实验五 细菌芽孢、荚膜的染色及观察 一、 实验目的和内容 目的：掌握细菌的芽孢及荚膜染色方法。 内容：1. 细菌的芽孢染色。 2. 细菌的荚膜染色。 二、 实验材料和用具 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）的斜面菌种。 二甲苯、香柏油、蒸馏水、5%孔雀水溶液、0.5%沙黄水溶液（或 0.05%碱性复红）、绘图墨 水（用滤纸过滤后备用）、1%结晶紫水溶液、20%硫酸铜水溶液。 显微镜、接种环、酒精灯、载玻片、盖玻片、小试管（1×6.5cm）、烧杯（300mL）、滴管、 试管夹、擦镜纸、吸水纸、木夹子。 三、 操作步骤 （一）芽孢染色法 1. 方法 1——Schaeffer-Fulton 氏染色法 （1）制片 取 37℃培养 18~24h 的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定。 （2）染色 加数滴孔雀绿染液于涂片上，用木夹夹住载玻片一端，在微火上加热至染料冒 蒸气并开始计时，维持 4~5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。 （3）水洗 倾去染液，待玻片冷却后，用缓流自来水冲洗，直至流出的水无色为止。勿用 瀑水对着菌膜冲洗，以免细菌被水冲掉。 （4）复染 用 0.5%沙黄水溶液（或 0.05%碱性复红）复燃 1~2min。 （5）水洗 用缓流水洗后，吸干。 （6）镜检 制片干燥后，用油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。 2. 方法 2——改良的 Schaeffer-Fulton 氏染色法 （1）制备菌悬液 加 1~2 滴水于小试管中，用接种环从斜面上挑取 2~3 环培养 18~24h 的 枯草芽孢杆菌菌苔于试管中，并充分混匀打散，制成浓稠的菌悬液。 所用菌种应掌握菌龄，以大部分细菌已形成芽孢囊为宜；取菌不宜太少。 （2）染色 加孔雀绿染液 2~3 滴于小试管中，用接种环搅拌使染料与菌液充分混合，然后 将试管置于沸水浴的烧杯中，加热染色 15~20min
（3）涂片固定用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，然后将涂片通过微火3次固定。（4）脱色水洗，直至流出的水无绿色为止。（5）复染用沙黄水溶液染色2~3min，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。（6）镜检干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。（二）英膜染色法1.Anthony氏法（1）制片取培养的褐球固氮菌制成涂片，空气中自然干燥（不可加热干燥固定）。（2）染色用1%的结晶紫水溶液染色2min。（3）脱色以20%的硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。（用吸水纸吸干后，立即加1~2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成）（4）镜检干后用油镜观察。菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。2.湿墨水法（1）制备菌和墨水混合液加一滴墨水于洁净的载玻片上，然后挑取少量褐球固氮菌与其充分混合均匀。（2）加盖玻片将一洁净盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以吸去多余的混合液。加盖玻片时勿留气泡，以免影响观察。（3）镜检干燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为荚膜。四、注意事项1.荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。2.供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。五、实验报告（一）绘图1．枯草芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。2.褐球固氮菌菌体及英膜的形态。（二）试制片，但不进行染色，观察是否能看到芽孢和荚膜？六、问题和思考1.．说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？2.通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？14
14 （3）涂片固定 用接种环挑取试管底部菌液数环于洁净的载玻片上，并涂成薄膜，然后将 涂片通过微火 3 次固定。 （4）脱色 水洗，直至流出的水无绿色为止。 （5）复染 用沙黄水溶液染色 2~3min，倾去染液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。 （6）镜检 干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，芽孢囊及营养体为红色。 （二）荚膜染色法 1. Anthony 氏法 （1）制片 取培养的褐球固氮菌制成涂片，空气中自然干燥（不可加热干燥固定）。 （2）染色 用 1%的结晶紫水溶液染色 2min。 （3）脱色 以 20%的硫酸铜水溶液冲洗，用吸水纸吸干残液。（用吸水纸吸干后，立即加 1~2 滴香柏油于涂片处，以防止 CuSO4结晶的形成） （4）镜检 干后用油镜观察。菌体染成深紫色，菌体周围的荚膜呈淡紫色。 2. 湿墨水法 （1）制备菌和墨水混合液 加一滴墨水于洁净的载玻片上，然后挑取少量褐球固氮菌与其 充分混合均匀。 （2）加盖玻片 将一洁净盖玻片盖在混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，轻轻按压以 吸去多余的混合液。加盖玻片时勿留气泡，以免影响观察。 （3）镜检 干燥后用油镜观察。背景灰色，菌体较暗，在菌体周围呈现明亮的透明圈即为 荚膜。 四、 注意事项 1. 荚膜染色涂片不要用加热固定，以免荚膜皱缩变形。 2. 供芽孢染色用的菌种应控制菌龄，使大部分芽孢仍保留在菌体上为宜。 五、 实验报告 （一）绘图 1. 枯草芽孢杆菌的菌体及芽孢形态，芽孢的着生位置。 2. 褐球固氮菌菌体及荚膜的形态。 （二）试制片，但不进行染色，观察是否能看到芽孢和荚膜？ 六、 问题和思考 1. 说明芽孢染色法的原理。用简单染色法能否观察到细菌的芽孢？ 2. 通过荚膜染色法染色后，为什么被包在荚膜里面的菌体着色而荚膜不着色？