实验二十四IMViC与硫化氢试验一、实验目的和内容目的：了解IMViC与硫化氢反应的原理及在肠道菌鉴定中的意义和方法。内容：学习5种检查肠道杆菌的生化试验。二、实验材料和用具大肠杆菌、产气肠杆菌。蛋白陈水培养基、葡萄糖蛋白陈水培养基、柠檬酸盐斜面培养基、醋酸铅培养基。在配制柠像酸盘斜面培养基时，其PH不要偏高，以浅绿色为宣，呵哚试验中用的蛋白藤水培养基中宣选用色氨酸含量高的蛋白陈，如用胰蛋白水解素得到的蛋白陈较好。甲基红指示剂、40%KOH、5%α-酚、乙醚、吲哚试剂等。三、操作步骤1.接种与培养（1）用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培养基中（硫化氢试验），置37℃培养48小时。（2）将上述二菌分别接种于2支蛋白陈水培养基（哚试验），2支葡萄糖蛋白陈水培养基（甲基红试验和伏-普试验），2支柠檬酸盐斜面培养基和2支醋酸铅培养基中，置37℃培养2天。2.结果观察（1）硫化氢试验培养48小时后观察黑色硫化铅的产生。硫化氢试验是检测硫化氢的产生，是用于肠道细菌检查的常用生化试验。有些细菌能分解含硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐等，就形成黑色的硫化铁沉淀物。以半胱氨酸为例，其化学反应过程如下：CH2SHCHNH.COOH+H2OCH:COCOOH+H2S 1 +NH; tHS+Pb（CHsC00）2-PbS↓+2CHsC00H（黑色）大肠杆菌为阴性，产气肠杆菌为阴性。（2）吲哚试验于培养2天后的蛋白陈水培养基内加3~4滴乙醚，摇动数次，静置1~3分62
62 实验二十四 IMViC 与硫化氢试验 一、实验目的和内容 目的：了解 IMViC 与硫化氢反应的原理及在肠道菌鉴定中的意义和方法。 内容：学习 5 种检查肠道杆菌的生化试验。 二、实验材料和用具 大肠杆菌、产气肠杆菌。 蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、柠檬酸盐斜面培养基、醋酸铅培养基。 在配制柠檬酸盐斜面培养基时，其 pH 不要偏高，以浅绿色为宜，吲哚试验中用的蛋白胨水培养基中宜选用 色氨酸含量高的蛋白胨，如用胰蛋白水解素得到的蛋白胨较好。 甲基红指示剂、40%KOH、5%α-萘酚、乙醚、吲哚试剂等。 三、操作步骤 1. 接种与培养 （1）用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入 2 支醋酸铅培养基中（硫化氢试验）， 置 37℃培养 48 小时。 （2）将上述二菌分别接种于 2 支蛋白胨水培养基（吲哚试验），2 支葡萄糖蛋白胨水培养基 （甲基红试验和伏-普试验），2 支柠檬酸盐斜面培养基和 2 支醋酸铅培养基中，置 37℃培养 2 天。 2. 结果观察 （1）硫化氢试验 培养 48 小时后观察黑色硫化铅的产生。 硫化氢试验是检测硫化氢的产生，是用于肠道细菌检查的常用生化试验。有些细菌能分解含 硫的有机物，如胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸等产生硫化氢，硫化氢一遇培养基中的铅盐或铁盐 等，就形成黑色的硫化铁沉淀物。 以半胱氨酸为例，其化学反应过程如下： CH2SHCHNH2COOH+H2O→CH3COCOOH+H2S↑+NH3↑ H2S+Pb（CH3COO）2→PbS↓+2CH3COOH （黑色） 大肠杆菌为阴性，产气肠杆菌为阴性。 （2）吲哚试验 于培养 2 天后的蛋白胨水培养基内加 3~4 滴乙醚，摇动数次，静置 1~3 分
钟，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性反应。配制蛋白陈水培养基，所用的蛋白藤最好用含色氨酸高的，如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋白陈中色氨酸含量较高，吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白陈中的色氨酸产生吲哚和内酮酸。吲哚与对二甲基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。（3）甲基红试验培养2天后，将1支葡萄糖蛋白陈水培养物内加入甲基红试剂2滴，培养基变红色者为阳性，变黄色者为阴性。注意甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性反应。甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2）即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个试验在区分大肠杆菌和产气肠杆菌上仍然是有价值的。这两个细菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后期仍能维持酸性pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。因此大肠杆菌为阳性反应，产气肠杆菌为阴性反应。（4）伏-普试验培养2天后，将另1支葡萄糖蛋白陈水培养物内加入5~10滴40%K0H，然后加入等量的5%α-萘酚溶液，用力振荡，再放入37℃温箱中保温15~30分钟，以加快反应速度。若培养物呈红色者，为伏-普反应阳性。伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙酰。二乙酰与蛋白陈中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普反应阳性；不产生红色化合物者为阴性反应。有时为了使反应更为明显，可加入少量含胍基的化合物，如肌酸等。产气肠杆菌为阳性反应，大肠杆菌为阴性反应。（5）柠檬酸盐试验培养48小时后观察柠檬酸斜面培养基上有无细菌生长和是否变色。蓝色为阳性，绿色为阴性。柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用。有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源，如产气肠杆菌；而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基pH升高，当加入1%漠麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会63
63 钟，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入 2 滴吲哚试剂，在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳 性反应。 配制蛋白胨水培养基，所用的蛋白胨最好用含色氨酸高的，如用胰蛋白酶水解酪素得到的蛋 白胨中色氨酸含量较高。 吲哚试验是用来检测吲哚的产生。有些细菌能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲 哚和丙酮酸。吲哚与对二甲基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。但并非所有微生物都具有分解 色氨酸产生吲哚的能力，因此吲哚试验可以作为一个生物化学检测的指标。 大肠杆菌吲哚反应阳性，产气肠杆菌为阴性。 （3）甲基红试验 培养 2 天后，将 1 支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入甲基红试剂 2 滴，培 养基变红色者为阳性，变黄色者为阴性。 注意甲基红试剂不要加得太多，以免出现假阳性反应。 甲基红试验是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。当细菌代谢糖产生 酸时，培养基就会变酸，使加入培养基的甲基红指示剂由橘黄色（pH6.3）变为红色（pH4.2）， 即甲基红反应。尽管所有的肠道微生物都能发酵葡萄糖产生有机酸，但这个试验在区分大肠杆菌 和产气肠杆菌上仍然是有价值的。这两个细菌在培养的早期均产生有机酸，但大肠杆菌在培养后 期仍能维持酸性 pH4，而产气肠杆菌则转化有机酸为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使 pH 升至大约 6。因此大肠杆菌为阳性反应，产气肠杆菌为阴性反应。 （4）伏-普试验 培养 2 天后，将另 1 支葡萄糖蛋白胨水培养物内加入 5~10 滴 40%KOH，然 后加入等量的 5%α-萘酚溶液，用力振荡，再放入 37℃温箱中保温 15~30 分钟，以加快反应速度。 若培养物呈红色者，为伏-普反应阳性。 伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力，如丙酮酸。 丙酮酸进行缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，此化合物在碱性条件下能被空气中的氧气氧化成二乙 酰。二乙酰与蛋白胨中精氨酸的胍基作用，生成红色化合物，即伏-普反应阳性；不产生红色化 合物者为阴性反应。有时为了使反应更为明显，可加入少量含胍基的化合物，如肌酸等。 产气肠杆菌为阳性反应，大肠杆菌为阴性反应。 （5）柠檬酸盐试验 培养 48 小时后观察柠檬酸斜面培养基上有无细菌生长和是否变色。蓝 色为阳性，绿色为阴性。 柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸盐是否被利用。有些细菌能够利用柠檬酸钠作为碳源，如产 气肠杆菌；而另一些细菌则不能利用柠檬酸盐，如大肠杆菌。细菌在分解柠檬酸盐及培养基中的 磷酸铵后，产生碱性化合物，使培养基 pH 升高，当加入 1%溴麝香草酚蓝指示剂时，培养基就会
由绿色变为深蓝色。溴香草酚蓝的指示范围为：pH小于6.0时呈黄色，pH在6.0~7.0时为绿色，pH大于7.6时呈蓝色。四、实验报告将实验结果填入下表。“+”表示阳性反应，“_”表示阴性反应。IMViC试验硫化氢菌名吲哚试验甲基红试验伏-普试验柠檬酸盐试验试验大肠杆菌产气肠菌对照五、问题和思考1．讨论IMViC试验在医学检验上的意义。2．解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？3．为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏-普试验最初底物与最终产物有何异同处？为什么会出现不同？4.说明在硫化氢试验中，醋酸铅的作用。可以用哪种化合物代替醋酸铅？64
64 由绿色变为深蓝色。溴麝香草酚蓝的指示范围为：pH 小于 6.0 时呈黄色，pH 在 6.0~7.0 时为绿 色，pH 大于 7.6 时呈蓝色。 四、实验报告 将实验结果填入下表。“+”表示阳性反应，“-”表示阴性反应。 IMViC 试验 菌名 吲哚试验 甲基红试验 伏-普试验 柠檬酸盐试验 硫化氢 试 验 大肠杆菌 产气肠菌 对照 五、问题和思考 1. 讨论 IMViC 试验在医学检验上的意义。 2. 解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸 酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？ 3. 为什么大肠杆菌是甲基红反应阳性，而产气肠杆菌为阴性？这个试验与伏-普试验最初底 物与最终产物有何异同处？为什么会出现不同？ 4. 说明在硫化氢试验中，醋酸铅的作用。可以用哪种化合物代替醋酸铅？