实验十四培养基的配制一、实验目的和内容目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。内容：1.牛肉育蛋白陈培养基的配制2.高氏1号培养基的配制3.马丁氏培养基的配制二、实验材料和用具牛肉膏、蛋白陈、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红（1%的水溶液）、链霉素（1%的水溶液）、1mo1/LNaCl、1mo1/LNaOH、HCl、KNO3、NaC1、KHPO·3H0、MgS0.·7H0、FeSO·7H20。试管、三角形、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、PH试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、线绳、纱布。三、操作步骤（一）牛肉膏蛋白陈培养基的配制牛肉膏蛋白陈培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基本培养基，有时又称为普通培养基。其配方如下：牛肉膏3g，蛋白陈10g，NaC15g，琼脂15~20g，水1000ml，pH7.4~7.6.1.称药品按实际用量计算后，按培养基配方比例依次准确称取牛肉膏、蛋白陈、NaC1放入烧杯中，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面血中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可放在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉音便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。蛋白陈及易吸潮，在称量时动作要迅速。称药品时要严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。2.加热溶化在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按1.5%~2.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行，节省时间。34
34 实验十四 培养基的配制 一、 实验目的和内容 目的：学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤。 内容：1. 牛肉膏蛋白胨培养基的配制 2. 高氏 1 号培养基的配制 3. 马丁氏培养基的配制 二、 实验材料和用具 牛肉膏、蛋白胨、琼脂、可溶性淀粉、葡萄糖、孟加拉红（1%的水溶液）、链霉素（1%的水 溶液）、1mol/L NaCl、1mol/L NaOH、HCl、KNO3、NaCl、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O。 试管、三角形、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、pH 试纸、棉花、牛皮纸、记号笔、 线绳、纱布。 三、 操作步骤 （一）牛肉膏蛋白胨培养基的配制 牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基本培养基，有时又称为普通培养 基。其配方如下： 牛肉膏 3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂 15~20g，水 1000ml，pH 7.4~7.6. 1. 称药品 按实际用量计算后，按培养基配方比例依次准确称取牛肉膏、蛋白胨、NaCl 放 入烧杯中，牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可放 在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出 纸片。蛋白胨及易吸潮，在称量时动作要迅速。 称药品时要严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。 瓶盖也不要盖错。 2. 加热溶化 在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻璃搅匀，然后，在石棉网上加 热使其溶解，或在磁力搅拌器上加热溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配 制固体培养基时，将称好的琼脂放入已溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。在制 备用三角瓶盛固体培养基时，一般也可先将一定量的液体培养基分装于三角瓶中，然后按 1.5%~2.0%的量将琼脂直接分别加入各三角瓶中，不必加热溶化，而是灭菌和加热溶化同步进行， 节省时间
在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养集中，影响细菌生长。3.调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mo1/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之用1mol/LHCl进行调节。对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整pH。4.．过滤趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下，这一步是可以省去（本实验勿需过滤）。5．分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。（1）液体分装分装高度以试管高度的1/4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜。如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确（2）固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的量以不超过三角瓶容积的一半为宜。（3）半固体分装试管一般以试管高度的1/3左右为宜，灭菌后垂直待凝。6.加塞培养基分装完毕后，将试管口或三角烧瓶口用封口膜（棉塞或试管帽等）封口，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。7．包扎封口后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好.用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶封口后，外包牛皮纸或双层报纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。8.灭菌将上述培养基以0.103MPa，121.3℃湿热灭菌20min。如因特殊情况不能及时灭菌则应放入冰箱内暂存。9.搁置斜面将灭菌的试管培养基冷至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端搁置在玻棒或其它合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。35
35 在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时，需不断搅拌，以防琼脂糊底烧焦。 配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养集中，影响细菌生长。 3. 调 pH 在未调 pH 前，先用精密 pH 试纸测量培养基的原始 pH，如果偏酸，用滴管向培养 基中逐滴加入 1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用 pH 试纸测其 pH，直至 pH 达 7.6。反之 ， 用 1mol/L HCl 进行调节。 对于有些要求 pH 较精确的微生物，其 pH 的调节可用酸度计进行。 pH 不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制 pH 低的琼脂培养基时，若预先调好 pH 并 在高压蒸汽下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性 pH 条件下灭菌，再调整 pH。 4. 过滤 趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利于某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情 况下，这一步是可以省去（本实验勿需过滤）。 5. 分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装时可用三角漏 斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。 （1）液体分装 分装高度以试管高度的 1/4 左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定， 一般以不超过三角瓶容积的一半为宜。如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少； 有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。 （2）固体分装 分装试管，其装量不超过管高的 1/5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的量 以不超过三角瓶容积的一半为宜。 （3）半固体分装 试管一般以试管高度的 1/3 左右为宜，灭菌后垂直待凝。 6. 加塞 培养基分装完毕后，将试管口或三角烧瓶口用封口膜（棉塞或试管帽等）封口， 以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。 7. 包扎 封口后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝 水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好.用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶封 口后，外包牛皮纸或双层报纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培 养基名称、组别、配制日期。 8. 灭菌 将上述培养基以 0.103MPa，121.3℃湿热灭菌 20min。如因特殊情况不能及时灭菌， 则应放入冰箱内暂存。 9. 搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至 50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），将试管口端 搁置在玻棒或其它合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜
10.无菌检查将灭菌培养基放入37℃的温室中培养24~48h，以检查灭菌是否彻底，无菌生长即可使用。或贮存于冰箱或清洁的橱柜内，备用。（二）高氏1号培养基的配制高氏1号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其培养如下：可溶性淀粉20g，NaC10.5g，KNO31g，KHP04·3H200.5g，MgS0,·7H00.5g，FeS07Hz0.01g，琼脂15~25g，水1000ml，pH7.4~7.6。1.称量和溶解按配方先称取可溶性溶粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次逐一溶化。对微量成分FeS0,·7H0可先配成高浓度的贮备液按比例换算后再加入，方法是先在100ml水中加入1g的FeS0·7H20配成0.01g/ml，再在1000ml培养基中加1m1的0.01g/ml的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶化过程同牛肉膏蛋白陈培养基配制。2.pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白陈培养基配制。（三）马铃薯培养基的配制马铃薯培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。其配方如下马铃薯200g，蔗糖（或葡萄糖）20g，琼脂15~20g，水1000ml，自然pH。1.称量和溶解马铃薯去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，准确称取其他各成分加入，待各成分完全溶化后，补足水分到所需体积。2.分装、加塞、包扎、灭菌、无菌检查同牛肉膏蛋白陈培养基配制。3.链霉素的加入链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至45℃左右时才能加入。可先将链霉素配成1%的溶液（配好的链霉素溶液保存于-20℃），在100ml培养基中加1%链霉素液0.3ml，使每毫升培养基中含链霉素30ug。四、实验报告记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。五、问题和思考1.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？2．培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？36
36 10. 无菌检查 将灭菌培养基放入 37℃的温室中培养 24~48h，以检查灭菌是否彻底，无菌 生长即可使用。或贮存于冰箱或清洁的橱柜内，备用。 （二）高氏 1 号培养基的配制 高氏 1 号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其培养如下： 可溶性淀粉 20g，NaCl 0.5g，KNO3 1g，K2HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g， FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂 15~25g，水 1000ml，pH 7.4~7.6。 1. 称量和溶解 按配方先称取可溶性溶粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状， 再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次 逐一溶化。对微量成分 FeSO4·7H2O 可先配成高浓度的贮备液按比例换算后再加入，方法是先在 100ml 水中加入 lg 的 FeSO4·7H2O 配成 0.01 g/ml，再在 1 000ml 培养基中加 1m1 的 0.01 g／ml 的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼 脂溶化过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2. pH 调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 （三）马铃薯培养基的配制 马铃薯培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。其配方如下： 马铃薯 200g，蔗糖(或葡萄糖) 20g，琼脂 15~20g，水 1000ml，自然 pH。 1. 称量和溶解 马铃薯去皮，切成块煮沸 30min，然后用纱布过滤，准确称取其他各成分 加入，待各成分完全溶化后，补足水分到所需体积。 2. 分装、加塞、包扎、灭菌、无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 3. 链霉素的加入 链霉素受热容易分解，所以临用时，将培养基融化后待温度降至 45℃左 右时才能加入。可先将链霉素配成 l％的溶液（配好的链霉素溶液保存于-20℃），在 100ml 培 养基中加 1％链霉素液 0.3ml，使每毫升培养基中含链霉素 30μg。 四、 实验报告 记录本实验配制培养基的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。 五、 问题和思考 1. 在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？ 2. 培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？