实验二十二大分子物质的水解试验一、实验目的和内容目的：证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法内容：学习大分子物质的水解试验。二、实验材料和用具枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、普通变形杆菌（Proteusvularis）。固体油脂培养基、固体淀粉培养基、明胶培养基试管、石蕊牛奶试管、尿素琼脂试管、革兰氏染色用卢戈氏碘液（Lugol'siodinesolution）、无菌平板、无菌试管、接种环、接种针、试管架。三、操作步骤（一）淀粉水解试验1.将固体淀粉培养基溶化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。2.用记号笔在平板底部划成四部分。3.将枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单抱菌分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别在四部分写上菌名。4.将平板倒置在37℃温箱中培养24小时。5.观察各种细菌的生长情况，将平板打开盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平皿中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。如菌苔周圈出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。（二）油脂水解试验1.将溶化的固体油脂培养基冷却至50℃左右时，充分摇荡，使油脂均匀分布。无菌操作倒入平板，待凝。2.用记号笔在平板底部划成四部分，分别标上菌名。3.将枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单孢菌分别用无菌操作划十字接种于平板的相对应部分的中心。4.将平板倒置，于37℃温箱中培养24小时。57
57 实验二十二 大分子物质的水解试验 一、 实验目的和内容 目的：证明不同微生物对各种有机大分子的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的 酶系统。掌握进行微生物大分子水解试验的原理和方法。 内容：学习大分子物质的水解试验。 二、 实验材料和用具 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、普 通变形杆菌（Proteus vularis）。 固体油脂培养基、固体淀粉培养基、明胶培养基试管、石蕊牛奶试管、尿素琼脂试管、革兰 氏染色用卢戈氏碘液（Lugol’s iodine solution）、无菌平板、无菌试管、接种环、接种针、试管架。 三、 操作步骤 （一）淀粉水解试验 1. 将固体淀粉培养基溶化后冷却至 50℃左右，无菌操作制成平板。 2. 用记号笔在平板底部划成四部分。 3. 将枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单孢菌分别在不同的部分划线接 种，在平板的反面分别在四部分写上菌名。 4. 将平板倒置在 37℃温箱中培养 24 小时。 5. 观察各种细菌的生长情况，将平板打开盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平皿中，轻轻旋转 平板，使碘液均匀铺满整个平板。 如菌苔周围出现无色透明圈，说明淀粉已被水解，为阳性。透明圈的大小可初步判断该菌水解淀粉能力的 强弱，即产生胞外淀粉酶活力的高低。 （二）油脂水解试验 1. 将溶化的固体油脂培养基冷却至 50℃左右时，充分摇荡，使油脂均匀分布。无菌操作倒 入平板，待凝。 2. 用记号笔在平板底部划成四部分，分别标上菌名。 3. 将枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单孢菌分别用无菌操作划十字接 种于平板的相对应部分的中心。 4. 将平板倒置，于 37℃温箱中培养 24 小时
5.取出平板，观察菌苔颜色，如出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。（三）明胶水解试验1.取三支明胶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。2.用接种针分别穿刺接种（见图22-1）枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。3.将接种后的试管置20℃中，培养2~5天。4.观察明胶液化情况（图22-2）。图22-1垂直式穿刺接种法图22-2明胶穿刺液化的形态（四）石蕊牛奶试验1．取两支石蕊牛奶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。2.分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。3.将接种后的试管置35℃中，培养24~48小时。4.观察培养基颜色变化。石蕊在酸性条件下为粉红色，碱性条件下为紫色，而被还原时为白色。（五）尿素试验1.取两支尿素培养基斜面试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。2.分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。3.将接种后的试管置35℃中，培养24~48小时。4.观察培养基颜色变化。尿素酶存在时为红色，无尿素酶时应为黄色。四、实验报告将结果填入下表。“+”表示阳性，“_”表示阴性菌名淀粉水解试验脂肪水解试验石蕊牛奶试验尿素试验明胶液化试验枯草芽孢杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌普通变形杆菌58
58 5. 取出平板，观察菌苔颜色，如出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。 （三）明胶水解试验 1. 取三支明胶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。 2. 用接种针分别穿刺接种（见图 22-1）枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌。 3. 将接种后的试管置 20℃中，培养 2~5 天。 4. 观察明胶液化情况（图 22-2）。 图 22-1 垂直式穿刺接种法 图 22-2 明胶穿刺液化的形态 （四）石蕊牛奶试验 1. 取两支石蕊牛奶培养基试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。 2. 分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。 3. 将接种后的试管置 35℃中，培养 24~48 小时。 4. 观察培养基颜色变化。石蕊在酸性条件下为粉红色，碱性条件下为紫色，而被还原时为 白色。 （五）尿素试验 1. 取两支尿素培养基斜面试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。 2. 分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。 3. 将接种后的试管置 35℃中，培养 24~48 小时。 4. 观察培养基颜色变化。尿素酶存在时为红色，无尿素酶时应为黄色。 四、 实验报告 将结果填入下表。“+”表示阳性，“-”表示阴性 菌 名 淀粉水解试验 脂肪水解试验 明胶液化试验 石蕊牛奶试验 尿素试验 枯草芽孢杆菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 普通变形杆菌
五、问题和思考1.你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？2.不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？3.接种后的明胶试管可以在35℃培养，在培养后你必须做什么才能证明水解的存在？4.解释在石蕊牛奶中的石蕊为什么能起到氧化还原指示剂的作用？5.为什么尿素试验可用于鉴定Proteus细菌？59
59 五、 问题和思考 1. 你怎样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？ 2. 不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？ 3. 接种后的明胶试管可以在 35℃培养，在培养后你必须做什么才能证明水解的存在？ 4. 解释在石蕊牛奶中的石蕊为什么能起到氧化还原指示剂的作用？ 5. 为什么尿素试验可用于鉴定 Proteus 细菌？