实验十六土壤的稀释分离和纯化一、实验目的和内容目的：学习从土壤中分离微生物的方法。内容：1.用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。2.用平板划线方法分离微生物。3.学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。二、实验材料和用具金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）和普通变形菌（Proteusvulgaris）斜面菌种。已灭菌的牛肉膏、高氏1号、土豆蔗糖固体培养基各一瓶，49.5ml无菌水并带有玻璃珠1瓶、4.5ml无菌水6管、80%乳酸、10%酚液、95%乙醇。无菌培养血12套、1ml无菌移液管10支、土壤样品、天平、称量纸、药勺、试管架、记号笔、涂布器、接种环等。三、操作步骤（一）土壤稀释分离1.取土样取表层以下510cm处的土样，放入灭菌的带中备用，或放在4℃冰箱中暂存。2.制备稀释液（要无菌操作）（1）制备土壤悬液：称取土样0.5g，迅速放入盛49.5ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约10～20min，使土样与水充分混合，将菌分散，即成为10的土壤悬液。（2）稀释：用无菌移液管吸从中吸取10土壤悬液0.5ml注入盛有4.5ml无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀，即为10稀释液。然后再用一支无菌移液管从此试管中吸取0.5ml注入另一盛有4.5ml无菌水的试管中，以此类推制成10、10、10″、10°、10各种稀释度的土壤溶液（图16-1）。注意：操作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差。40
40 实验十六 土壤的稀释分离和纯化 一、实验目的和内容 目的：学习从土壤中分离微生物的方法。 内容：1. 用稀释法分离细菌、放线菌和霉菌。 2. 用平板划线方法分离微生物。 3. 学习斜面接种及穿刺接种等无菌操作技术。 二、实验材料和用具 金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)和普通变形菌（Proteus vulgaris）斜面菌种。 已灭菌的牛肉膏、高氏 1 号、土豆蔗糖固体培养基各一瓶，49.5ml 无菌水并带有玻璃珠 1 瓶、4.5ml 无菌水 6 管、80%乳酸、10%酚液、95%乙醇。 无菌培养皿 12 套、1ml 无菌移液管 10 支、土壤样品、天平、称量纸、药勺、试管架、记号笔、涂布 器、接种环等。 三、操作步骤 （一）土壤稀释分离 1. 取土样 取表层以下 5～10cm 处的土样，放入灭菌的带中备用，或放在 4℃冰箱中暂存。 2. 制备稀释液（要无菌操作） （1）制备土壤悬液：称取土样 0.5g，迅速放入盛 49.5ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇 约 10～20min，使土样与水充分混合，将菌分散，即成为 10-2的土壤悬液。 （2）稀释：用无菌移液管吸从中吸取 10-2土壤悬液 0.5ml 注入盛有 4.5ml 无菌水的试管中，吹吸三 次，使充分混匀，即为 10-3稀释液。然后再用一支无菌移液管从此试管中吸取 0.5ml 注入另一盛有 4.5ml 无菌水的试管中，以此类推制成 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7各种稀释度的土壤溶液（图 16-1）。注意：操 作时管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要将移液管插入液面，吹吸 3 次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差
1g土乳醉土豆培养基牛肉膏培养基高氏培养基图16-1稀释法分离土壤微生物操作过程图解3．倒平板将牛肉膏蛋白陈培养基、高氏1号琼脂培养基、土豆煎糖培养基加热溶化，待冷至55~60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10%酚数滴。然后分别倒平板，每种培养基倒四皿。倒平板的方法是：右手持盛培养基的试管或三角烧瓶置火焰旁边，用左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用右手手掌边缘或小指与无名指夹住拔出的管（瓶）塞，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞则不必夹在手指中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养血盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15ml（图16-2），加盖后轻轻摇动培养血，使培养基均匀分布在培养血底部，然后平置于桌面上，待凝后即成为平板。也可将平血放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养血，再注入培养基，摇匀后制成平板。最好是将平板放室温2或37℃培养24小时，检查无3大：菌落及血盖无冷凝水后再使用。图16-2倒平板操作图41
41 图 16-1 稀释法分离土壤微生物操作过程图解 3. 倒平板 将牛肉膏蛋白胨培养基、高氏 1 号琼脂培养基、土豆蔗糖培养基加热溶化，待冷至 55～ 60℃时，向高氏 1 号琼脂培养基中加入 10％酚数滴。然后分别倒平板，每种培养基倒四皿。 倒平板的方法是：右手持盛培养基的试管或三角烧瓶置火焰旁边，用左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞， 用右手手掌边缘或小指与无名指夹住拔出的管（瓶）塞，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完， 则管塞或瓶塞则不必夹在手指中。试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝， 迅速倒入培养基约 15ml（图 16-2），加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置 于桌面上，待凝后即成为平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开 培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板。最好是将平板放室温 2～3 天，或 37℃培养 24 小时，检查无 菌落及皿盖无冷凝水后再使用。 图 16-2 倒平板操作图
图16-3平板涂布操作图4.平板涂布法测定菌落数的方法（1）细菌：取10、10°两管稀释液各0.1ml分别放入已标记好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀（图16-3），室温下静置5~10min，使菌液吸附进培养基。（2）放线菌：取10、10两管稀释液，用与细菌相同的方法，便可制成放线菌平板。（3）霉菌：取10~、10两管稀释液，用与细菌相同的方法，便可制成霉菌平板。平板涂布方法：将0.1ml菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置上。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。稀释混合平板法：此法与稀释涂布平板法基本相同，无菌操作也一样，所不同的是先分别吸取0.5m110″、10、10、10″、10″、10稀释度的土壤悬液对号放入平皿，然后再倒入溶化后冷却到45℃左右的培养基，边倒入边摇匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀，待冷凝成平板后，分别倒置于28℃和37℃温室中培养后，再挑取单个菌落，直至获得纯培养。5.培养将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于28~30℃中恒温培养，细菌培养1~2d，放线菌培养5~7d，霉菌培养3~5d。可用于观察菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。6.挑菌落将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室中培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物，若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。（二）平板划线分离微生物1.倒平板按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称。42
42 图16-3 平板涂布操作图 4. 平板涂布法测定菌落数的方法 （1）细菌：取 10-6、10-7两管稀释液各 0.1ml 分别放入已标记好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在 培养基表面轻轻地涂布均匀（图 16-3），室温下静置 5~10min，使菌液吸附进培养基。 （2）放线菌：取 10-4、10-5两管稀释液，用与细菌相同的方法，便可制成放线菌平板。 （3）霉菌：取 10-2、10-3两管稀释液，用与细菌相同的方法，便可制成霉菌平板。 平板涂布方法：将 0.1ml 菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置上。右手拿无菌涂棒平放在平板 培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回 推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。 稀释混合平板法：此法与稀释涂布平板法基本相同，无菌操作也一样，所不同的是先分别吸取 0.5ml10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀释度的土壤悬液对号放入平皿，然后再倒入溶化后冷却到 45℃左 右的培养基，边倒入边摇匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀，待冷凝成平板后，分别倒置于 28℃ 和 37℃温室中培养后，再挑取单个菌落，直至获得纯培养。 5. 培养 将接种好的细菌、放线菌、霉菌平板倒置，即皿盖朝下放置，于 28~30℃中恒温培养，细 菌培养 1~2d，放线菌培养 5~7d，霉菌培养 3~5d。可用于观察菌落，用于进一步纯化分离或直接转接斜面。 6. 挑菌落 将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置 28℃和 37℃温室中培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是 否为单一的微生物，若发现有杂菌，需再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。 （二）平板划线分离微生物 1. 倒平板 按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称
2.划线分离使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样，在相应培养基平板中划线分离，划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：（1）用接种环以无菌操作挑取菌样一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3~4条，再转动培养血约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线（图17-4,A)。（2）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线（图16-4）。3.培养划线完毕后，盖上皿盖，倒置于相应温室中培养。方法同“土壤稀释分离”。图16-4两种平板划线操作图WWM(c)(a)(b)(a)图16-5平行划线方式示意图a和b用于稀释液中，可连续划线：c和d用于较浓的菌样，分数次划线，每次划线后要烧接种环，然后在划下一区。43
43 2．划线分离 使用接种环，从待纯化的菌落或待分离的斜面菌种中沾取少量菌样，在相应培养基平 板中划线分离，划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释， 使之形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种： （1）用接种环以无菌操作挑取菌样一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线 3~4 条，再转动 培养皿约 70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同 样的方法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线（图 17-4，A）。 （2）将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线（图 16-4）。 3. 培养 划线完毕后，盖上皿盖，倒置于相应温室中培养。方法同“土壤稀释分离”。 图16-4 两种平板划线操作图 图16-5 平行划线方式示意图 a和b用于稀释液中，可连续划线； c和d用于较浓的菌样，分数次划线，每次划线后要烧接种环，然后在划下一 区
23D1091112常用微生物的接种工具a.接种环b.玻璃刮铲1.塑料套2.铝柄3.镍铬丝4.接种针5.接种钩6.接种环7.接种圈8.接种锄9.三角形刮铲10.平刮铲11.移液管12.滴管图16-6常用微生物的接种工具（三）斜面接种和穿刺接种1.斜面接种（1）取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），然后用无菌操作方法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面中。（2）接种的方法是：用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下部开始，一直划至上部（图16-7A）。注意划线要轻，不可把培养基划破。（3）接种后30℃恒温培养，细菌培养48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。2.穿刺接种（1）取两支新鲜半固体牛肉营蛋白陈柱状培养基，做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等）。分别接入金黄色葡萄球菌和普通变形菌。（2）接种的方法是：用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的中心穿入其底部（但不要穿透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动（图17-7B）。（3）接种后30℃恒温培养，24h后观察，比较两种菌的生长结果。44
44 图 16-6 常用微生物的接种工具 （三）斜面接种和穿刺接种 1. 斜面接种 （1）取新鲜固体斜面培养基，分别做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等），然后用无菌操作方 法，把待接菌种接入以上新鲜培养基斜面中。 （2）接种的方法是：用接种环沾取少量待接菌种，然后在新鲜斜面上“之”字形划线，方向是从下 部开始，一直划至上部（图 16-7 A）。注意划线要轻，不可把培养基划破。 （3）接种后 30℃恒温培养，细菌培养 48h，放线菌、霉菌培养至孢子成熟方可取出保存。 2. 穿刺接种 （1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨柱状培养基，做好标记（写上菌名、接种日期、接种人等）。分 别接入金黄色葡萄球菌和普通变形菌。 （2）接种的方法是：用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的中心穿入其底部（但不要穿 透），然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动（图 17-7 B）。 （3）接种后 30℃恒温培养，24h 后观察，比较两种菌的生长结果