实验四细菌的革兰氏染色一、实验目的和内容目的：初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法的步骤。内容：1.制作细菌染色装片。2.进行革兰氏染色法操作。二、基本原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色，最后用复染剂（如石炭酸复红液、沙黄等）复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色），该菌属于革兰氏阴性菌。这种不同是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂（乙醇)处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、含脂量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、含脂量高，当用脱色剂（乙醇）处理后，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的准确性，采用规范的染色方法是十分必要的。三、实验材料和用具金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大肠杆菌（E.coli）约24h营养琼脂斜面培养物革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等）、香柏油、二甲苯。显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。四、操作步骤（一）制片10
10 实验四 细菌的革兰氏染色 一、 实验目的和内容 目的：初步掌握细菌涂片方法及革兰氏染色法的步骤。 内容：1. 制作细菌染色装片。 2. 进行革兰氏染色法操作。 二、 基本原理 革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 C.Gram 所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区 分为革兰氏阳性菌（G+ ）和革兰氏阴性菌（G- ）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇（或 丙酮）脱色，最后用复染剂（如石炭酸复红液、沙黄等）复染。经此方法染色后，细胞保留初染 剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色 （红色），该菌属于革兰氏阴性菌。这种不同是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。 实际上，当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒 染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫-碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂(乙 醇)处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状 结构组成、壁厚、含脂量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水，使肽聚糖层的网状结构孔径 缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保 留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、含脂量高，当用脱色剂 (乙醇)处理后，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容 易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 革兰氏染色反应是细菌重要的鉴别特征，为保证染色结果的准确性，采用规范的染色方法是 十分必要的。 三、 实验材料和用具 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（E.coli）约 24h 营养琼脂斜面培养物。 革兰氏染色液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液等）、香柏油、二甲苯。 显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、吸水纸、试管、小滴管、酒精灯。 四、 操作步骤 （一）制片
1．涂菌取载玻片，滴一小滴生理盐水于玻片中央，用接种环以无菌操作方法从菌斜面上挑取少许菌苔，在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约1cm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性2.干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥（温度不宜过高）。3.固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。（二）染色1.初染于制片上滴加结晶紫染液（以刚好将菌膜覆盖为宜），染色1~2min，水洗。2.媒染用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约1min，水洗。3．脱色用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约20-30s。4.复染滴加石炭酸复红液复染1~2min，水洗。5.镜检用滤纸吸干，油镜观察6.混合涂片染色按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。图4-1示革兰氏染色操作过程11
11 1. 涂菌 取载玻片，滴一小滴生理盐水于玻片中央，用接种环以无菌操作方法从菌斜面上 挑取少许菌苔，在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约 1cm 的菌膜。涂菌后将接种环火焰 灭菌。 要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 2. 干燥 于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥（温度不宜过高）。 3. 固定 目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌 涂片膜向上，通过火焰 3 次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。 （二）染色 1. 初染 于制片上滴加结晶紫染液（以刚好将菌膜覆盖为宜），染色 1~2min，水洗。 2. 媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖约 1min ,水洗。 3. 脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，在白色背景下，用滴管流加 95%的乙醇 脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。 革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌， 脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，脱色时间一般约 20~30s。 4. 复染 滴加石炭酸复红液复染 1~2min，水洗。 5. 镜检 用滤纸吸干，油镜观察 6. 混合涂片染色 按上述方法，在同一载玻片上，以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作混合涂 片、染色、镜检进行比较。 图 4-1 示革兰氏染色操作过程
图4-1革兰氏染色程序1.加草酸铵结晶紫染1min：2.水洗；3.加碘液媒染1min；4.水洗；5.95%乙醇脱色20~30s：6.水洗：7.番红复染2min；8.水洗；9.用吸水纸吸干（三）结果革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。五、注意事项1.涂片务求均匀，切忌过厚。2.在染色过程中，不可使染色液干。3.脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌。4.老龄均因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。六、实验报告绘制染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。七、问题与思考1.你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？2.你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。3.试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义。12
12 图 4-1 革兰氏染色程序 1.加草酸铵结晶紫染 1min；2.水洗；3.加碘液媒染 1min；4.水洗；5.95%乙醇脱色 20~30s； 6.水洗；7.番红复染 2min；8.水洗；9.用吸水纸吸干 （三）结果 革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。 五、 注意事项 1. 涂片务求均匀，切忌过厚。 2. 在染色过程中，不可使染色液干涸。 3. 脱色时间十分重要，过长，则脱色过度，会使阳性菌被染成阴性菌。 4. 老龄均因体内核酸减少，会使阳性菌被染成阴性菌，故不能选用。 六、 实验报告 绘制染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。 七、 问题与思考 1. 你认为哪些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？ 2. 你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。 3. 试分析革兰氏染色法在细菌分类中的意义