实验十七化学因素对微生物的影响一、实验目的和内容目的：了解常用化学药品对微生物的作用，掌握常用消毒剂的浓度和使用方法。内容：1.学习滤纸片法测定化学消毒剂的杀菌作用2.学习测定石炭酸系数的方法。二、实验材料和用具大肠杆菌、白色葡萄球菌（Staphylococcusalbus）。牛肉膏蛋白陈琼脂培养基、牛肉膏蛋白陈液体培养基、2.5%碘酒、0.1%升汞、5%石炭酸、75%酒精、100%酒精、1%来苏尔、新洁尔灭、0.005%龙胆紫、0.05%龙胆紫、无菌生理盐水、无菌培养血、无菌滤纸片、试管、吸管、三角涂棒等。三、操作步骤（一）滤纸片法测定化学消毒剂的杀（抑）菌作用1.将已灭菌并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白陈琼脂培养基倒入无菌平皿中，水平放置待凝固。2.用无菌吸管吸取0.2ml培养18h的白色葡萄球菌菌液加入到上述平板中，用无菌三角涂棒涂布均匀。3.将涂布好的平板底皿划分成4~6等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称。4．用无菌镊子将已灭菌的小圆形滤纸片分别浸入装有各种消毒剂溶液的试管中浸湿。注意取出滤纸片时保证过滤纸所含消毒剂溶液量基本一致，并在试管内壁沥去多余药液。图17-1贴滤纸片图17-2圆滤纸片法测定化学消毒剂的杀（抑）菌作用无菌操作将滤纸片贴在平板相应区域，平板中间贴上浸有无菌生理盐水的滤纸片作为对照（图17-1）。46
46 实验十七 化学因素对微生物的影响 一、 实验目的和内容 目的：了解常用化学药品对微生物的作用，掌握常用消毒剂的浓度和使用方法。 内容：1. 学习滤纸片法测定化学消毒剂的杀菌作用 2. 学习测定石炭酸系数的方法。 二、 实验材料和用具 大肠杆菌、白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）。 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、牛肉膏蛋白胨液体培养基、2.5%碘酒、0.1%升汞、5%石炭酸、75% 酒精、100%酒精、1%来苏尔、新洁尔灭、0.005%龙胆紫、0.05%龙胆紫、无菌生理盐水、无菌培 养皿、无菌滤纸片、试管、吸管、三角涂棒等。 三、 操作步骤 （一）滤纸片法测定化学消毒剂的杀（抑）菌作用 1. 将已灭菌并冷却至 50℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌平皿中，水平放置待凝 固。 2. 用无菌吸管吸取 0.2ml 培养 18h 的白色葡萄球菌菌液加入到上述平板中，用无菌三角涂 棒涂布均匀。 3. 将涂布好的平板底皿划分成 4~6 等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称。 4. 用无菌镊子将已灭菌的小圆形滤纸片分别浸入装有各种消毒剂溶液的试管中浸湿。 注意取出滤纸片时保证过滤纸所含消毒剂溶液量基本一致，并在试管内壁沥去多余药液。 图 17-1 贴滤纸片 图 17-2 圆滤纸片法测定化学消毒剂的杀（抑）菌作用 无菌操作将滤纸片贴在平板相应区域，平板中间贴上浸有无菌生理盐水的滤纸片作为对照 （图 17-1）
5.将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于37℃温室中，培养24小时后取出观察抑（杀）菌圈大小（图17-2），并说明其杀菌强弱。（二）石炭酸系数的测定1.将石碳酸稀释配成1/50、1/60、1/70、1/80及1/90等不同的浓度，分别取5m1装入相应的试管中。2.将待测消毒剂（来苏尔）稀释配成1/150、1/200、1/250、1/300及1/500等不同的浓度，各取5ml装入相应的试管。3.取盛有已灭菌的牛肉膏蛋白陈液体培养基的试管30支，其中15支标明石炭酸的5种浓度，每种浓度3管（分别标记上5、10及15min），另外1支5标明来苏尔的5种浓度，同样每种浓度3管（分别标记上5、10及15min）。4.在上述盛有不同浓度的石炭酸和来苏尔溶液的试管中各接入0.5ml大肠杆菌菌液并摇匀。注意吸取菌液时要将菌液吹打均匀，保证每个试管中接入的均量一致。每管自接种时起分别在5、10和15min用接种环从各管内取一环菌液接入已标记有相应石炭酸和来苏尔浓度的装有牛肉膏蛋白陈液体培养基的试管中。5.将上述试管置37℃温室中培养48h后，观察并记录细菌的生长情况。细菌生长者试管内培养液混浊，以“+”表示；不生长者培养液澄清，以“_”表示。6.计算石碳酸系数值找出将大肠杆菌在药液中处理5min后仍能生长，而处理10min和15min后不生长的石炭酸及来苏尔的最大稀释倍数，计算二者的比值。例如，若来苏尔和石炭酸在10min内杀死大肠杆菌的最大稀释倍数分别是250和70，则来苏尔的石炭酸系数为250/70=3.6。四、实验报告1.各种化学药品对白色葡萄球菌的作用能力消毒剂抑（杀）菌圈直径/消毒剂抑（杀）菌圈直径/m2.5%碘酒1%来苏尔0.1%升汞0.25%新洁尔灭5%石碳酸0.005%龙胆紫75%乙醇0.05%龙胆紫100%乙醇2.石炭酸系数的测定和计算消毒剂稀释倍数生长状况石碳酸系数47
47 5. 将上述贴好滤纸片的含菌平板倒置放于 37℃温室中，培养 24 小时后取出观察抑（杀） 菌圈大小（图 17-2），并说明其杀菌强弱。 （二）石炭酸系数的测定 1. 将石碳酸稀释配成 1/50、1/60、1/70、1/80 及 1/90 等不同的浓度，分别取 5ml 装入相 应的试管中。 2. 将待测消毒剂（来苏尔）稀释配成 1/150、1/200、1/250、1/300 及 1/500 等不同的浓度， 各取 5ml 装入相应的试管。 3. 取盛有已灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管 30 支，其中 15 支标明石炭酸的 5 种浓 度，每种浓度 3 管（分别标记上 5、10 及 15min），另外 1 支 5 标明来苏尔的 5 种浓度，同样每 种浓度 3 管（分别标记上 5、10 及 15min）。 4. 在上述盛有不同浓度的石炭酸和来苏尔溶液的试管中各接入 0.5ml 大肠杆菌菌液并摇 匀。 注意吸取菌液时要将菌液吹打均匀，保证每个试管中接入的均量一致。 每管自接种时起分别在 5、10 和 15min 用接种环从各管内取一环菌液接入已标记有相应石炭 酸和来苏尔浓度的装有牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中。 5. 将上述试管置 37℃温室中培养 48h 后，观察并记录细菌的生长情况。细菌生长者试管内 培养液混浊，以“+”表示；不生长者培养液澄清，以“-”表示。 6. 计算石碳酸系数值 找出将大肠杆菌在药液中处理 5min 后仍能生长，而处理 10min 和 15min 后不生长的石炭酸及来苏尔的最大稀释倍数，计算二者的比值。例如，若来苏尔和石炭酸 在 10min 内杀死大肠杆菌的最大稀释倍数分别是 250 和 70，则来苏尔的石炭酸系数为 250/70=3.6。 四、 实验报告 1. 各种化学药品对白色葡萄球菌的作用能力 消 毒 剂 抑（杀）菌圈直径/mm 消 毒 剂 抑（杀）菌圈直径/mm 2.5%碘酒 1%来苏尔 0.1%升汞 0.25%新洁尔灭 5%石碳酸 0.005%龙胆紫 75%乙醇 0.05%龙胆紫 100%乙醇 2. 石炭酸系数的测定和计算 消毒剂 稀释倍数 生 长 状 况 石碳酸系数
51015/min5060石碳酸708090150200来苏尔250300500五、问题和思考1.影响抑（杀）菌圈大小的因素有哪些？抑（杀）菌圈大小是否准确地反映出化学消毒剂抑（杀）菌能力的强弱？2.在你的实验中，75%和100%的乙醇对白自色葡萄球菌的作用效果有何不同？你知道医院常用作消毒剂的乙醇浓度是多少吗？请说明用此浓度乙醇的原因和机理？3.某公司推出一种新型饮料，并声明是100%纯天然产品，不含防腐剂，利用你所掌握的微生物学知识，试设计一个简单实验来初步判断此饮料是否含防腐剂。48
48 5 10 15/min 50 60 70 80 石碳酸 90 150 200 250 300 来苏尔 500 五、 问题和思考 1. 影响抑（杀）菌圈大小的因素有哪些？抑（杀）菌圈大小是否准确地反映出化学消毒剂 抑（杀）菌能力的强弱？ 2. 在你的实验中，75%和 100%的乙醇对白色葡萄球菌的作用效果有何不同？你知道医院常 用作消毒剂的乙醇浓度是多少吗？请说明用此浓度乙醇的原因和机理？ 3. 某公司推出一种新型饮料，并声明是 100%纯天然产品，不含防腐剂，利用你所掌握的微 生物学知识，试设计一个简单实验来初步判断此饮料是否含防腐剂