实验二十七噬菌体的分离与纯化一、实验目的和内容目的：学习分离、纯化噬菌体的基本原理和方法，观察噬菌斑。内容：分离、纯化大肠杆菌噬菌体。二、实验材料和用具大肠杆菌、阴沟污水。500ml三角烧瓶内装三倍浓缩的普通肉膏蛋白陈液体培养基100ml、试管液体培养基、上层琼脂培养基（含琼脂0.7%，试管分装，每管4ml）、底层琼脂平板（含培养基10ml，琼脂2%）。灭菌吸管、灭菌玻璃涂布器、灭菌滤器（孔径0.22u㎡），灭菌抽滤瓶，恒温水浴箱，真空泵等。三、操作步骤（一）噬菌体的分离1.制备菌悬液37℃培养18h的大肠杆菌斜面一支，加4ml无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。2.增殖培养于100ml三倍浓缩的肉膏蛋白陈液体培养基的三角烧瓶中，加入污水样品200ml与大肠杆菌悬液2ml，37℃振荡培养12~24小时。3.制备裂解液将以上混合培养液2500r/min离心15分钟。将灭菌滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，常规操作连接真空抽滤装置（如图27-1）。美真生图27-1过滤装置将离心上清液倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液经37℃培养过夜，以作无菌检查。液体抽滤完毕，应打开安全阀增压后再停真空泵，否则将产生滤液回流，污染真空泵。4.．确证试验经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证实噬菌体的存在。71
71 实验二十七 噬菌体的分离与纯化 一、 实验目的和内容 目的：学习分离、纯化噬菌体的基本原理和方法，观察噬菌斑。 内容：分离、纯化大肠杆菌噬菌体。 二、 实验材料和用具 大肠杆菌、阴沟污水。 500ml 三角烧瓶内装三倍浓缩的普通肉膏蛋白胨液体培养基 100ml、试管液体培养基、上层 琼脂培养基（含琼脂 0．7%，试管分装，每管 4ml）、底层琼脂平板（含培养基 10ml，琼脂 2%）。 灭菌吸管、灭菌玻璃涂布器、灭菌滤器（孔径 0.22μm），灭菌抽滤瓶，恒温水浴箱，真空 泵等。 三、 操作步骤 （一）噬菌体的分离 1. 制备菌悬液 37℃培养 18h 的大肠杆菌斜面一支，加 4ml 无菌水洗下菌苔，制成菌悬液。 2. 增殖培养 于 100ml 三倍浓缩的肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶中，加入污水样品 200ml 与大肠杆菌悬液 2ml，37℃振荡培养 12~24 小时。 3. 制备裂解液 将以上混合培养液 2500r/min 离心 15 分钟。 将灭菌滤器用无菌操作安装于灭菌抽滤瓶上，常规操作连接真空抽滤装置（如图 27-1）。 图 27-1 过滤装置 将离心上清液倒入滤器，开动真空泵，过滤除菌。所得滤液经 37℃培养过夜，以作无菌检查。 液体抽滤完毕，应打开安全阀增压后再停真空泵，否则将产生滤液回流，污染真空泵。 4. 确证试验 经无菌检查没有细菌生长的滤液作进一步证实噬菌体的存在
（1）手肉膏蛋白陈琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均匀的一薄层。（2）待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，置37℃培养过夜。如果在滴加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑，便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。（二）噬菌体的纯化1.如已证明确有噬菌体存在，则用接种环取滤液一环接种于液体培养基内，再加入0.1ml大肠杆菌悬液，使混和。2.取上层琼脂培养基，溶化并冷却至48℃（可预先溶化、冷却，放48℃水浴箱内备用），加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2ml，立即混匀。3.并立即倒入底层培养基上，铺匀。置37℃培养24小时。4．此时分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，需要进一步纯化。噬菌斑纯化的操作比较简单，通常采用接种针（或无菌牙签）在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内，37℃培养。5.待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。以上（1)（2）（3)三步骤，目的是在平板上得到单个噬菌斑，能否达到目的，决定于所分离得到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量，最好在做无菌试验的同时，由教师先做预备试验，若平板上的噬菌斑连成一片，则需减少接种量（少于一环）或增加液体培养基的量；若噬菌斑太少，则增加接种量。以免全班同学重做。（三）高效价噬菌体的制备刚分离纯化所得到的噬菌体往往效价不高，需要进行增殖。将纯化了的噬菌体滤液与液体培养基按1：10的比例混合，再加入大肠杆菌悬液适量（可与噬菌体滤液等量或1/2的量），培养，使增殖，如此重复移种数次，最后过滤，可得到高效价的噬菌体制品。四、实验报告绘图表示平板上出现的噬菌斑。五、问题和思考1.能否用伤寒杆菌（肠道菌）悬液作为宿主细胞分离大肠杆菌（肠道菌）的噬菌体，为什么?2．若要分离化脓性细菌的噬菌体，取什么样品材料最容易得到？3.试比较分离纯化噬菌体与分离纯化细菌、放线菌等在基本原理和具体方法上的异同。72
72 （1）于肉膏蛋白胨琼脂平板上加一滴大肠杆菌悬液，再用灭菌玻璃涂布器将菌液涂布成均 匀的一薄层。 （2）待平板菌液干后，分散滴加数小滴滤液于平板菌层上面，置 37℃培养过夜。如果在滴 加滤液处形成无菌生长的透明噬菌斑，便证明滤液中有大肠杆菌噬菌体。 （二）噬菌体的纯化 1. 如已证明确有噬菌体存在，则用接种环取滤液一环接种于液体培养基内，再加入 0.1ml 大肠杆菌悬液，使混和。 2. 取上层琼脂培养基，溶化并冷却至 48℃（可预先溶化、冷却，放 48℃水浴箱内备用）， 加入以上噬菌体与细菌的混合液 0.2ml，立即混匀。 3. 并立即倒入底层培养基上，铺匀。置 37℃培养 24 小时。 4. 此时分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，需要进一步纯化。噬菌斑纯化的操作 比较简单，通常采用接种针（或无菌牙签）在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有 大肠杆菌的液体培养基内， 37℃培养。 5. 待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。 以上(1)(2)(3)三步骤，目的是在平板上得到单个噬菌斑，能否达到目的，决定于所分离得 到的噬菌体滤液的浓度和所加滤液的量，最好在做无菌试验的同时，由教师先做预备试验，若平 板上的噬菌斑连成一片，则需减少接种量（少于一环）或增加液体培养基的量；若噬菌斑太少， 则增加接种量。以免全班同学重做。 （三）高效价噬菌体的制备 刚分离纯化所得到的噬菌体往往效价不高，需要进行增殖。 将纯化了的噬菌体滤液与液体培养基按 1∶10 的比例混合，再加入大肠杆菌悬液适量（可与 噬菌体滤液等量或 1/2 的量），培养，使增殖，如此重复移种数次，最后过滤，可得到高效价的 噬菌体制品。 四、 实验报告 绘图表示平板上出现的噬菌斑。 五、 问题和思考 1. 能否用伤寒杆菌（肠道菌）悬液作为宿主细胞分离大肠杆菌（肠道菌）的噬菌体，为什 么？ 2. 若要分离化脓性细菌的噬菌体，取什么样品材料最容易得到？ 3. 试比较分离纯化噬菌体与分离纯化细菌、放线菌等在基本原理和具体方法上的异同
4．新分离到的噬菌体滤液要证实确有噬菌体存在，除本实验用的平板法观察噬菌斑的存在以外，还可用什么方法？如何证明？73
73 4. 新分离到的噬菌体滤液要证实确有噬菌体存在，除本实验用的平板法观察噬菌斑的存在 以外，还可用什么方法？如何证明？