实验十二微生物细胞的显微镜直接计数法一、实验目的和内容目的：了解血细胞计数板的构造和计数原理，掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。内容：显微镜直接测定微生物总细胞数。二、实验材料和用具酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）培养液。血细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管。三、操作步骤1.血细胞计数板的构造血球计数板通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方格即为计数室。血细胞计数板构造如图12-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格。但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数都是相同的，即16×25=400小方格，如图12-2。每一个大方格边长为1mm，则每一大方格的面积为1mm，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm（万分之一毫升）。血球计数板的构造见图12-1。XB-K-250.01mm#1/400mm2#55LVVV盖玻片中央平台计数板图12-1血球计数板构造（一）上：正面图：下：纵切面图在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成1ml菌液中的总菌数。27
27 实验十二 微生物细胞的显微镜直接计数法 一、 实验目的和内容 目的：了解血细胞计数板的构造和计数原理，掌握使用血细胞计数板进行微生物计数的方法。 内容：显微镜直接测定微生物总细胞数。 二、 实验材料和用具 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）培养液。 血细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管。 三、 操作步骤 1. 血细胞计数板的构造 血球计数板通常是一块特制的载玻片，其上由四条槽构成三个平台。中间较宽的平台又被一 短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分九个大方格，中间的大方 格即为计数室。血细胞计数板构造如图 12-1。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方 格分成 16 个中方格，而每个中方格又分成 25 个小方格；另一种是一个大方格分成 25 个中方格， 而每个中方格又分成 16 个小方格。但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格数 都是相同的，即 16×25=400 小方格，如图 12-2。每一个大方格边长为 1mm，则每一大方格的面 积为 1mm2 ，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为 0.1mm，所以计数室的容积为 0.1mm3 （万分之一毫升）。血球计数板的构造见图 12-1。 图 12-1 血球计数板构造（一）上：正面图；下：纵切面图 在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘上 16 或 25， 就得出一个大方格中的总菌数，然后再换算成 1ml 菌液中的总菌数。 0.01mm 1/400mm2 XB-K-25 计数板 盖玻片 中央平台
下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，则：1ml菌液中的总菌数=A/5×25×10*×B=50000A·B（个）同理，如果是16个中方格的计数板，1ml菌液中的总菌数=A/5×16×10*×B=32000A·B（个）2.微生物细胞数量的测定（1）菌悬液制备以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。（2）镜检计数室在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干后才能进行计数。（3）加样品将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室，一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。小方格中方格16×25A放大后的方格网B中间大方格（计数室）图12-2血球计数板构造（二）（4）显微镜计数加样后静正5分钟，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有510个菌体为宜。每个计数室选5个中格（可选4个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线28
28 下面以一个大方格有 25 个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为 A，菌 液稀释倍数为 B，则： 1ml 菌液中的总菌数=A/5×25×104 ×B = 50000A·B（个） 同理，如果是 16 个中方格的计数板， 1ml 菌液中的总菌数=A/5×16×104 ×B = 32000A·B（个） 2. 微生物细胞数量的测定 （1）菌悬液制备 以无菌生理盐水将酿酒酵母制成浓度适当的菌悬液。 （2）镜检计数室 在加样前，先对计数板的计数室进行镜检。若有污物，则需清洗，吹干 后才能进行计数。 （3）加样品 将清洁干燥的血细胞计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的酿酒 酵母菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴（不宜过多），让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自行进入计数室， 一般计数室均能充满菌液。注意不可有气泡产生。 A 放大后的方格网 B 中间大方格（计数室） 图 12-2 血球计数板构造（二） （4）显微镜计数 加样后静止 5 分钟，然后将血细胞计数板置于显微镜载物台上，先用低倍镜 找到计数室所在位置，然后换成高倍镜进行计数。在计数前若发现菌液太浓或太稀，需重新调节 稀释度后再计数。一般样品稀释度要求每小格内约有 5～10 个菌体为宜。每个计数室选 5 个中格 （可选 4 个角和中央的一个中格）中的菌体进行计数。位于格线上的菌体一般只数上方和右边线
上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。（5）清洗血球计数板使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹于。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若不干净，则必须重复洗涤至干净为止。四、实验报告将结果记录于下表中。A表示五个中方格中的总菌数：：B表示菌液稀释倍数。二室各中格中菌数AB菌数/m1平均值12345第一室第二室五、问题和思考根据你实验的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误差，力求准确？29
29 上的。如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，即作为两个菌体计数。计数一个样品要从 两个计数室中计得的平均数值来计算样品的含菌量。 （5）清洗血球计数板 使用完毕后，将血细胞计数板在水龙头上用水冲洗干净，切勿用硬物 洗刷，洗完后自行晾干或用吹风机吹干。镜检，观察每小格内是否有残留菌体或其他沉淀物。若 不干净，则必须重复洗涤至干净为止。 四、实验报告 将结果记录于下表中。 A 表示五个中方格中的总菌数； B 表示菌液稀释倍数。 各中格中菌数 1 2 3 4 5 A B 二室 平均值 菌数/ml 第一室 第二室 五、问题和思考 根据你实验的体会，说明用血细胞计数板计数的误差主要来自哪些方面？应如何尽量减少误 差，力求准确？