实验三十四微生物菌种保藏一、实验目的和内容目的：了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。内容：1.学习斜面传代保藏方法。2.学习液体石蜡保藏方法。3.学习滤纸保藏方法。4.学习沙土管保藏方法。5.学习冷冻干燥保藏方法。6.学习液氮保藏方法。二、实验材料和用具大肠杆菌、假单胞菌、灰色链霉菌（Streptomycesgriseus）、酿酒酵母、产黄霉菌（Penicilliumchrysogenum)。肉汤培养基、马铃薯培养基、麦芽汁酵母膏培养基。液体石蜡、甘油、五氧化二磷、河沙、瘦黄土或红土、95%乙醇、10%盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰、无菌吸管、无菌滴管、无菌培养血、安管、冻干管、40目与100目筛子、油纸、滤纸条（0.5x1.2cm）、干燥器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱（-30℃）、超低温冰箱和液氮罐。三、 操作步骤以下几种保藏方法可根据实验室具体条件选做：（一）斜面法将菌种转接在适宜的固体斜面培养基上，待其充分生长后，用油纸将棉塞部分包扎好（斜面试管用带帽的螺旋试管为宜。这样培养基不易干，且螺旋帽不易长霉，如用棉塞，塞子要求比较干燥），置4℃冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类各异。霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2~4个月移种一次，普通细菌最好每月移种一次，假单胞菌两周传代一次，酵母菌间隔两个月。此法操作简单、使用方便、不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是保藏时间短、需定期传代，且易被污染，菌种的主要特性容易改变。（二）液体石蜡法87
87 实验三十四 微生物菌种保藏 一、 实验目的和内容 目的：了解并掌握菌种保藏的常用方法及其优缺点。 内容：1. 学习斜面传代保藏方法。 2. 学习液体石蜡保藏方法。 3. 学习滤纸保藏方法。 4. 学习沙土管保藏方法。 5. 学习冷冻干燥保藏方法。 6. 学习液氮保藏方法。 二、 实验材料和用具 大肠杆菌、假单胞菌、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、酿酒酵母、产黄霉菌（Penicillium chrysogenum）。 肉汤培养基、马铃薯培养基、麦芽汁酵母膏培养基。 液体石蜡、甘油、五氧化二磷、河沙、瘦黄土或红土、95％乙醇、10％盐酸、无水氯化钙、 食盐、干冰、无菌吸管、无菌滴管、无菌培养皿、安瓿管、冻干管、40 目与 100 目筛子、油纸、 滤纸条(0.5x1.2cm)、干燥器、真空泵、真空压力表、喷灯、L 形五通管、冰箱、低温冰箱(-30 ℃)、超低温冰箱和液氮罐。 三、 操作步骤 以下几种保藏方法可根据实验室具体条件选做： （一）斜面法 将菌种转接在适宜的固体斜面培养基上，待其充分生长后，用油纸将棉塞部分包扎好(斜面 试管用带帽的螺旋试管为宜。这样培养基不易干，且螺旋帽不易长霉，如用棉塞，塞子要求比较 干燥)，置 4℃冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类各异。霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存 2~4 个月移种一次，普通 细菌最好每月移种一次，假单胞菌两周传代一次，酵母菌间隔两个月。 此法操作简单、使用方便、不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染 杂菌等。缺点是保藏时间短、需定期传代，且易被污染，菌种的主要特性容易改变。 （二）液体石蜡法
1.将液体石蜡分装于试管或三角烧瓶中，塞上棉塞并用牛皮纸包扎，121℃灭菌30min，然后放在40℃温箱中使水汽蒸发后备用。2将需要保藏的菌种在最适宜的斜面培养基中培养，直到菌体健壮或孢子成熟。3.用无菌吸管吸取无菌的液体石蜡，加入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端1cm为准（图34-1)，使菌种与空气隔绝。4.将试管直立，置低温或室温下保存（有的微生物在室温下比在冰箱中保存的时间还要长）。此法实用而且效果较好。产孢子的霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏2年以上，有些酵母菌可保藏1~2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右，甚至用一般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在37℃温箱内，亦可保藏3个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大：同时也不便携带。从液体石蜡下面取培养物移种后接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别注意。（三）滤纸法1.滤纸条的准备将滤纸剪成0.5×1.2cm的小条装入0.6×8cm的安管中，每管装1~2片，用棉花塞上后经121℃灭菌30min。一做体石票科奥地荐基智山能谷智商花图34-1液体石蜡覆盖保藏图34-2滤纸保藏法的安管熔封2.保护剂的配制配制20%脱脂奶，装在三角瓶或试管中，121℃灭菌25min。待冷后，随机取出几份分别置28℃、37℃培养过夜，然后各取0.2ml涂布在肉汤平板上或斜面上进行无菌检查，确认无菌后方可使用，其余的保护剂置4℃存放待用。3.菌种培养将需保存的菌种在适宜的斜面培养基上培养，直到生长半满。4.菌悬液的制备取无菌脱脂奶约2~3ml加入待保存的菌种斜面试管内。用接种环轻轻地将菌苔刮下，制成菌悬液。88
88 1. 将液体石蜡分装于试管或三角烧瓶中，塞上棉塞并用牛皮纸包扎，121℃灭菌 30min，然 后放在 40℃温箱中使水汽蒸发后备用。 2. 将需要保藏的菌种在最适宜的斜面培养基中培养，直到菌体健壮或孢子成熟。 3. 用无菌吸管吸取无菌的液体石蜡，加入已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端１cm 为准(图 34-1)，使菌种与空气隔绝。 4. 将试管直立，置低温或室温下保存(有的微生物在室温下比在冰箱中保存的时间还要长)。 此法实用而且效果较好。产孢子的霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏 2 年以上，有些酵母菌可保 藏 1~2 年，一般无芽孢细菌也可保藏 1 年左右，甚至用—般方法很难保藏的脑膜炎球菌，在 37 ℃温箱内，亦可保藏 3 个月之久。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺 点是保存时必须直立放置，所占位置较大；同时也不便携带。 从液体石蜡下面取培养物移种后接种环在火焰上烧灼时，培养物容易与残留的液体石蜡一起飞溅，应特别 注意。 （三）滤纸法 1. 滤纸条的准备 将滤纸剪成 0.5×1.2cm 的小条装入 0.6×8cm 的安瓿管中，每管装 1~2 片，用棉花塞上后经 121℃灭菌 30min。 图 34-1 液体石蜡覆盖保藏 图 34-2 滤纸保藏法的安瓿管熔封 2. 保护剂的配制 配制 20%脱脂奶，装在三角瓶或试管中，121℃灭菌 25min。待冷后，随 机取出几份分别置 28℃、37℃培养过夜，然后各取 0.2ml 涂布在肉汤平板上或斜面上进行无菌 检查，确认无菌后方可使用，其余的保护剂置 4℃存放待用。 3. 菌种培养 将需保存的菌种在适宜的斜面培养基上培养，直到生长半满。 4. 菌悬液的制备 取无菌脱脂奶约 2~3ml 加入待保存的菌种斜面试管内。用接种环轻轻地 将菌苔刮下，制成菌悬液
5.分装样品用无菌滴管（或吸管）吸取菌悬液滴在安管中的滤纸条上，每片滤纸条约0.5ml，塞上棉花。6．干燥将安管放入有五氧化二磷（或无水氯化钙）作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干。7.熔封与保存用火焰按图19-2所示将安管封口，置4℃或室温存放。8.取用安管使用菌种时，取存放的安管按图34-3，A所示用锉刀或砂轮从上端打开安管或按图34-3，B所示将安管口在火焰上烧热，加一滴冷水在烧热的部位使玻璃裂开，敲掉口端的玻璃，用无菌镊子取出滤纸，放入液体培养基中培养或加入少许无菌水用无菌吸管或毛细吸管吹打几次，使干燥物很快溶解后吸出，转入适当的培养基中培养。A图34-3取用安额管（四）沙土管法1.河沙处理取河沙若干加入10%盐酸，加热煮沸30min除去有机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸馏水冲洗，烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。2.土壤处理取非耕作层不含腐殖质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。3．沙土混合处理妥当的河沙与土壤按3：1比例掺合（或根据需要而用其他比例，甚至可全部作沙或土）均匀后，装入10×100mm的小试管或安管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌（通常采用间歇灭菌2~3次），最后烘干。89
89 5. 分装样品 用无菌滴管（或吸管）吸取菌悬液滴在安瓿管中的滤纸条上，每片滤纸条约 0.5ml，塞上棉花。 6. 干燥 将安瓿管放入有五氧化二磷（或无水氯化钙）作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽 气至干。 7. 熔封与保存 用火焰按图 19-2 所示将安瓿管封口，置 4℃或室温存放。 8. 取用安瓿管 使用菌种时，取存放的安瓿管按图 34-3，A 所示用锉刀或砂轮从上端打开 安瓿管或按图 34-3，B 所示将安瓿管口在火焰上烧热，加一滴冷水在烧热的部位使玻璃裂开，敲 掉口端的玻璃，用无菌镊子取出滤纸，放入液体培养基中培养或加入少许无菌水用无菌吸管或毛 细吸管吹打几次，使干燥物很快溶解后吸出，转入适当的培养基中培养。 图 34-3 取用安瓿管 （四）沙土管法 1. 河沙处理 取河沙若干加入 10%盐酸，加热煮沸 30min 除去有机质。倒去盐酸溶液，用 自来水冲洗至中性，最后一次用蒸馏水冲洗，烘干后用 40 目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。 2. 土壤处理 取非耕作层不含腐殖质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性。 烘干后碾碎，用 100 目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。 3. 沙土混合 处理妥当的河沙与土壤按 3：1 比例掺合（或根据需要而用其他比例，甚至可 全部作沙或土）均匀后，装入 10×100mm 的小试管或安瓿管中，每管分装 1g 左右，塞上棉塞， 进行灭菌（通常采用间歇灭菌 2~3 次），最后烘干
4.无菌检查每10支砂土管随机抽1支，将沙土到入肉汤培养基中，30℃培养40h，若发现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再作无菌实验，直至证明无菌后方可使用。5.菌悬液的制备取生长健壮的新鲜斜面菌种，加入2~3ml无菌水（每18×180mm的试管斜面菌种），用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。6.分装样品每支砂土管（注明标记后）加入0.5ml菌悬液（刚刚使沙土润湿为宜），用接种针拌勺匀。7.干燥将装有菌悬液的砂土管放入干燥器内，干燥器底部盛有干燥剂。用真空泵抽干水分后火焰封口（也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口）。8.保存置4℃温箱或室温干燥处，每隔一定的时间进行检测。此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。（五）冷冻真空干燥法1.冻干管的准备选用中性硬质玻璃，95材料为宜，内径约50mm，长约15cm，冻干管的洗涤按新购玻璃品洗净，烘干后塞上棉花。可将保藏编号、日期等打印在纸上，剪成小条，装入冻干管。121℃灭菌30min。2.菌种培养将要保藏的菌种接入斜面培养，产芽孢的细菌培养至芽孢从菌体脱落或产孢子的放线菌、霉菌至孢子丰满。3.保护剂的配制选用适宜的保护剂按使用浓度配制后灭菌，随机抽样培养后进行无菌检查（同滤纸法保护剂的无菌检查），确认无菌后才能使用。糖类物质用过滤器除菌，脱脂牛奶112℃，灭菌25min。4.菌悬液的制备吸2~3ml保护剂加入新鲜斜面菌种试管，用接种环将菌苔或孢子洗下振荡，制成菌悬液，真菌菌悬液则需置4℃平衡20~30min。5.分装样品用无菌毛细吸管吸取菌悬液加入冻干管，每管装约0.2ml。最后在几支冻干管中分别装入0.2ml、0.4ml蒸馏水作对照。6．预冻用程序控制温度仪进行分级降温。不同的微生物其最佳降温度率有所差异，一般由室温快速降至4℃，4℃至-40℃每分钟降低1℃，-40℃至-60℃以下每分钟降低5℃。条件不具备者，可以使用冰箱逐步降温。从室温到4℃到-12℃（三星级冰箱为-18℃）到-30℃到-70℃，也可用盐冰、干冰替代。90
90 4. 无菌检查 每 10 支砂土管随机抽 1 支，将沙土到入肉汤培养基中，30℃培养 40h，若发 现有微生物生长，所有砂土管则需重新灭菌，再作无菌实验，直至证明无菌后方可使用。 5. 菌悬液的制备 取生长健壮的新鲜斜面菌种，加入 2~3ml 无菌水（每 18×180mm 的试管 斜面菌种），用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。 6. 分装样品 每支砂土管（注明标记后）加入 0.5ml 菌悬液（刚刚使沙土润湿为宜），用 接种针拌匀。 7. 干燥 将装有菌悬液的砂土管放入干燥器内，干燥器底部盛有干燥剂。用真空泵抽干水 分后火焰封口（也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口）。 8. 保存 置 4℃温箱或室温干燥处，每隔一定的时间进行检测。 此法多用于产芽孢的细菌、产生孢子的霉菌和放线菌。在抗生素工业生产中应用广泛、效果 较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。 （五）冷冻真空干燥法 1. 冻干管的准备 选用中性硬质玻璃，95# 材料为宜，内径约 50mm，长约 15cm，冻干管的 洗涤按新购玻璃品洗净，烘干后塞上棉花。可将保藏编号、日期等打印在纸上，剪成小条，装入 冻干管。121℃灭菌 30min。 2. 菌种培养 将要保藏的菌种接入斜面培养，产芽孢的细菌培养至芽孢从菌体脱落或产孢 子的放线菌、霉菌至孢子丰满。 3. 保护剂的配制 选用适宜的保护剂按使用浓度配制后灭菌，随机抽样培养后进行无菌检 查（同滤纸法保护剂的无菌检查），确认无菌后才能使用。 糖类物质需用过滤器除菌，脱脂牛奶 112℃，灭菌 25min。 4. 菌悬液的制备 吸 2~3ml 保护剂加入新鲜斜面菌种试管，用接种环将菌苔或孢子洗下振 荡，制成菌悬液，真菌菌悬液则需置 4℃平衡 20~30min。 5. 分装样品 用无菌毛细吸管吸取菌悬液加入冻干管，每管装约 0.2ml。最后在几支冻干 管中分别装入 0.2ml、0.4ml 蒸馏水作对照。 6. 预冻 用程序控制温度仪进行分级降温。不同的微生物其最佳降温度率有所差异，一般 由室温快速降至 4℃，4℃至-40℃每分钟降低 1℃，-40℃至-60℃以下每分钟降低 5℃。条件不 具备者，可以使用冰箱逐步降温。从室温到 4℃到-12℃（三星级冰箱为-18℃）到-30℃到-70℃， 也可用盐冰、干冰替代
7.冷冻真空干燥启动冷冻真空干燥机制冷系统。当温度下降到-50℃以下时，将冻结好的样品迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直至样品干燥，也可按图34-4所示用简单的装置代替冻干机。水蒸气接真空泵冷诞器水蒸气冷凝含有微生物悬干冰、乙醇浮液的安额管接真空泵熔封管熔封玻璃棉（熔封时隔热）棉塞安颜管#726样品编号冻干的培养物B图34-4冷冻真空干燥法简易装置91
91 7. 冷冻真空干燥 启动冷冻真空干燥机制冷系统。当温度下降到-50℃以下时，将冻结好的 样品迅速放入冻干机钟罩内，启动真空泵抽气直至样品干燥，也可按图 34-4 所示用简单的装置 代替冻干机。 图 34-4 冷冻真空干燥法简易装置