实验三十三厌氧微生物的培养一、实验目的和内容目的：学习培养厌氧微生物的方法，了解厌氧微生物生长的特性，内容：学习几种厌氧微生物的培养方法。二、实验材料和用具巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭状芽孢杆菌，Clostridiumpas-teurianum）、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。肉膏蛋白陈琼脂培养基、肉培养基、10%Na0H，灭菌的石蜡凡士林（1:1）、焦性没食子酸棉花、厌氧罐、催化剂、产气袋、厌氧指示袋、灭菌的带橡皮塞或螺旋帽的大试管、灭菌的玻璃板（直径比培养皿大3~4cm）、灭菌的滴管，烧瓶，小刀等。三、操作步骤（一）碱性焦性没食子酸法1.大管套小管法在一已灭菌、带橡皮塞的大试管中，放入少许棉花和焦性没食子酸，焦性没食子酸的用量按它在过量碱液中能每克吸收100ml空气中的的氧来估计，本实验用量约0.5g。接种巴氏芽孢梭菌在小试管肉膏蛋白陈琼脂斜面上，迅速滴入10%的Na0H于大试管中使焦性没食子酸润湿，并立即放入除掉棉塞已接种厌氧菌的小试管斜面（小试管口朝上），塞上橡皮塞或拧上螺旋帽，置30℃培养，定期观察斜面上菌种的生长状况并记录。2.培养血法取玻璃板一块或用培养血盖，洗净，干燥后灭菌，铺上一薄层灭菌脱脂棉或纱布，将1g焦性没食子酸放于其上。用肉膏蛋白陈琼脂培养基倒平板，待凝固稍干燥后，在平板上一半划线接种巴氏芽孢梭菌，下一半划线接种荧光假单胞菌，并在皿底用记号笔作好标记。滴加10%Na0H溶液约2ml于焦性没食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即将已接种的平板覆盖于玻璃板上或培养血盖上，必须将脱脂棉全部罩住，焦性没食子酸反应物切勿与培养基表面接触。以溶化的石蜡凡士林液（即vaspar）密封皿底与玻璃板或皿盖的接触处，置30℃温箱培养，定期观察平板上菌种的生长状况并记录。（二）厌氧罐培养法1．用肉膏蛋白陈琼脂培养基倒平板。凝固干燥后，取两个平板，每个平板一半边划线接种巴氏芽孢梭菌，另一半边划线接种荧光假单胞菌，并标记好。取其中的一个已接种的平板置于厌氧罐的培养血支架上，而后放入厌氧培养罐内；另一个已接种的平板直接置30℃温室培养。85
85 实验三十三 厌氧微生物的培养 一、实验目的和内容 目的：学习培养厌氧微生物的方法，了解厌氧微生物生长的特性。 内容：学习几种厌氧微生物的培养方法。 二、实验材料和用具 巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭状芽孢杆菌，Clostridium pas- teurianum）、荧光假单胞菌 （Pseudomonas fluorescens）。 肉膏蛋白胨琼脂培养基、庖肉培养基、10%NaOH，灭菌的石蜡凡士林（1:1）、焦性没食子酸、 棉花、厌氧罐、催化剂、产气袋、厌氧指示袋、灭菌的带橡皮塞或螺旋帽的大试管、灭菌的玻璃 板（直径比培养皿大 3~4cm）、灭菌的滴管，烧瓶，小刀等。 三、操作步骤 （一）碱性焦性没食子酸法 1. 大管套小管法 在一已灭菌、带橡皮塞的大试管中，放入少许棉花和焦性没食子酸，焦 性没食子酸的用量按它在过量碱液中能每克吸收 100ml 空气中的的氧来估计，本实验用量约 0.5g。接种巴氏芽孢梭菌在小试管肉膏蛋白胨琼脂斜面上，迅速滴入 10％的 NaOH 于大试管中， 使焦性没食子酸润湿，并立即放入除掉棉塞已接种厌氧菌的小试管斜面（小试管口朝上），塞上 橡皮塞或拧上螺旋帽，置 30℃培养，定期观察斜面上菌种的生长状况并记录。 2. 培养皿法 取玻璃板一块或用培养皿盖，洗净，干燥后灭菌，铺上一薄层灭菌脱脂棉或 纱布，将 1g 焦性没食子酸放于其上。用肉膏蛋白陈琼脂培养基倒平板，待凝固稍干燥后，在平 板上一半划线接种巴氏芽孢梭菌，下一半划线接种荧光假单胞菌，并在皿底用记号笔作好标记。 滴加 10％NaOH 溶液约 2ml 于焦性没食子酸上，切勿使溶液溢出棉花，立即将已接种的平板覆盖 于玻璃板上或培养皿盖上，必须将脱脂棉全部罩住，焦性没食子酸反应物切勿与培养基表面接触。 以溶化的石蜡凡士林液（即 vaspar）密封皿底与玻璃板或皿盖的接触处，置 30℃温箱培养，定 期观察平板上菌种的生长状况并记录。 （二）厌氧罐培养法 1. 用肉膏蛋白胨琼脂培养基倒平板。凝固干燥后，取两个平板，每个平板一半边划线接种 巴氏芽孢梭菌，另一半边划线接种荧光假单胞菌，并标记好。取其中的一个已接种的平板置于厌 氧罐的培养皿支架上，而后放入厌氧培养罐内；另一个已接种的平板直接置 30℃温室培养
2.将已活化的催化剂倒入厌氧罐罐盖下面的多孔催化剂小盒内，拧紧催化剂盒的盒盖。3.剪开气体发生袋的一角，并迅速将此气体发生袋置于罐内金属架的夹上，再向袋中加入约10m1水。同时，由另一同学配合，剪开指示剂袋，将指示条暴露（还原态为无色，氧化态为蓝色），立即放进罐内。4.迅速盖好厌氧罐罐盖，将固定梁旋紧，置30℃温室培养，观察并记录罐内情况变化及菌种生长情况。（三）厄肉培养基法1.接种将盖在培养基液面的石蜡凡士林先在火焰上微微加热，使其边缘溶化，再用接种环将石蜡凡士林块拨成斜立或直立在液面上，然后用接种环或无菌滴管接种。接种后再将液面上的石蜡凡士林块在火焰上加热便其溶化，然后将试管直立静置，使石蜡凡士林凝固并密封培养基液面。2.培养将按上述方法分别接种了巴氏芽孢梭菌和荧光假单胞菌的疱肉培养基置30℃温室培养，并注意观察培养基肉渣颜色的变化和熔封石蜡凡士林层的状态。四、实验报告在你的实验中，好氧的荧光假单胞菌和厌氧的巴氏芽孢梭菌在几种厌氧培养方法中的生长状况如何？请对在厌氧培养条件下出现的如下情况进行分析、讨论①荧光假单胞菌不生长，而巴氏芽孢梭菌生长；②荧光假单胞菌和巴氏芽孢梭菌均生长：③荧光假单胞菌生长而巴氏芽孢梭菌不生长。五、问题和思考1．请设计一个实验方案，如何从土壤中分离、纯化和培养出厌氧菌。2．根据你所做的实验，你认为几种厌氧培养法各有何优、缺点？86
86 2. 将已活化的催化剂倒入厌氧罐罐盖下面的多孔催化剂小盒内，拧紧催化剂盒的盒盖。 3. 剪开气体发生袋的一角，并迅速将此气体发生袋置于罐内金属架的夹上，再向袋中加入 约 10 ml 水。同时，由另一同学配合，剪开指示剂袋，将指示条暴露（还原态为无色，氧化态为 蓝色），立即放进罐内。 4. 迅速盖好厌氧罐罐盖，将固定梁旋紧，置 30℃温室培养，观察并记录罐内情况变化及菌 种生长情况。 （三）庖肉培养基法 1. 接种 将盖在培养基液面的石蜡凡士林先在火焰上微微加热，使其边缘溶化，再用接种 环将石蜡凡士林块拨成斜立或直立在液面上，然后用接种环或无菌滴管接种。接种后再将液面上 的石蜡凡士林块在火焰上加热使其溶化，然后将试管直立静置，使石蜡凡士林凝固并密封培养基 液面。 2. 培养 将按上述方法分别接种了巴氏芽孢梭菌和荧光假单胞菌的庖肉培养基置 30℃温室 培养，并注意观察培养基肉渣颜色的变化和熔封石蜡凡士林层的状态。 四、实验报告 在你的实验中，好氧的荧光假单胞菌和厌氧的巴氏芽孢梭菌在几种厌氧培养方法中的生长状 况如何？请对在厌氧培养条件下出现的如下情况进行分析、讨论： ① 荧光假单胞菌不生长，而巴氏芽孢梭菌生长； ② 荧光假单胞菌和巴氏芽孢梭菌均生长； ③ 荧光假单胞菌生长而巴氏芽孢梭菌不生长。 五、问题和思考 1. 请设计一个实验方案，如何从土壤中分离、纯化和培养出厌氧菌。 2. 根据你所做的实验，你认为几种厌氧培养法各有何优、缺点？