实验四十二滤膜法测定水中大肠菌群实验目的和内容目的：学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。内容：学习使用滤膜法测定水中大肠菌群。二、实验材料和用具伊红美蓝琼脂平板或远藤氏琼脂平板、乳糖蛋白陈发酵管（内有倒置小套管）、灭菌水、河水或湖水。灭菌过滤器（漏斗、基座、带有孔橡皮塞的抽滤瓶分别灭菌，可用高压蒸汽灭菌）、镊子、夹钳、真空泵、滤膜、烧杯等。三、操作步骤1.滤膜灭菌将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸15分钟，共煮沸三次，前两次煮沸后换水洗涤2~3次再煮，以洗去滤膜上残留的溶剂。2.滤膜过滤器装置用无菌手续将已灭菌的过滤器基座、滤膜、漏斗和抽滤瓶按图42-1装配好，其中滤膜用灭①?一4?6?图42-1滤膜过滤器装置①漏斗：②抽滤瓶：?滤膜④过滤器基座：③夹子：灭菌三角瓶菌镊子（浸在95%酒精内，用时通过火焰灭菌）移至过滤器的基座上。其他可直接用手或夹钳操115
115 实验四十二 滤膜法测定水中大肠菌群 一、 实验目的和内容 目的：学习检测水中大肠菌群的方法，了解大肠菌群数量与水质状况的关系。 内容：学习使用滤膜法测定水中大肠菌群。 二、 实验材料和用具 伊红美蓝琼脂平板或远藤氏琼脂平板、乳糖蛋白胨发酵管（内有倒置小套管）、灭菌水、河 水或湖水。 灭菌过滤器（漏斗、基座、带有孔橡皮塞的抽滤瓶分别灭菌，可用高压蒸汽灭菌）、镊子、 夹钳、真空泵、滤膜、烧杯等。 三、 操作步骤 1. 滤膜灭菌 将滤膜放入装有蒸馏水的烧杯中，加热煮沸 15 分钟，共煮沸三次，前两次煮沸后换水洗涤 2~3 次再煮，以洗去滤膜上残留的溶剂。 2. 滤膜过滤器装置 用无菌手续将已灭菌的过滤器基座、滤膜、漏斗和抽滤瓶按图 42-1 装配好，其中滤膜用灭 图 42-1 滤膜过滤器装置 漏斗；抽滤瓶；滤膜；过滤器基座；夹子；灭菌三角瓶 菌镊子（浸在 95%酒精内，用时通过火焰灭菌）移至过滤器的基座上。其他可直接用手或夹钳操
作，但不要碰到伸入抽滤瓶的橡皮塞部分，以免染菌。3.将抽滤瓶接上真空泵。4.加水样过滤直径35mm的滤膜，所过滤的水量以培养后长出的菌落数不多于50个为适宜。一般清洁的深井水或经处理过的河水与湖水等可取样300~500ml；对比较清洁的河水或湖水，可取样1~100ml：严重污染的水样可先进行稀释；未知的水样可做三个稀释度，选择菌落数合适的稀释度进行计算。本次实验于过滤器漏斗内加入比较清洁的河水或湖水100ml，加盖。5.开动真空泵进行油滤。6.抽完后，加入等量的灭菌水继续抽滤，目的是冲洗漏斗壁。7.滤毕，关上真空泵，用灭菌镊子取滤膜边缘，将没有细菌的一面紧贴在远藤氏琼脂平板或伊红美蓝琼脂平板上如图42-2。滤膜与培养基之间不得有气泡。一灭菌镊子滤膜膜座滤膜表面的37C培养24h细菌菌落数乳糖发醇EMB琼脂平板阳性菌落图42-2从滤膜座上将滤膜转移到EMB琼脂平板上及培养后的菌落图8.将平板倒置于37℃下培养22~24小时。9.挑取符合大肠菌群菌落特征的菌落，进行革兰氏染色、镜检。（1）深紫黑色，有金属光泽。（2）紫黑色，不带或略带金属光泽。（3）淡紫红色，中心颜色较深。10.经染色证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，再接种在乳糖蛋白陈发酵管中，经37℃培养116
116 作，但不要碰到伸入抽滤瓶的橡皮塞部分，以免染菌。 3. 将抽滤瓶接上真空泵。 4. 加水样过滤 直径 35mm 的滤膜，所过滤的水量以培养后长出的菌落数不多于 50 个为适宜。一般清洁的深 井水或经处理过的河水与湖水等可取样 300~500 ml；对比较清洁的河水或湖水，可取样 1~100ml； 严重污染的水样可先进行稀释；未知的水样可做三个稀释度，选择菌落数合适的稀释度进行计算。 本次实验于过滤器漏斗内加入比较清洁的河水或湖水 100ml，加盖。 5. 开动真空泵进行油滤。 6. 抽完后，加入等量的灭菌水继续抽滤，目的是冲洗漏斗壁。 7. 滤毕，关上真空泵，用灭菌镊子取滤膜边缘，将没有细菌的一面紧贴在远藤氏琼脂平板 或伊红美蓝琼脂平板上如图 42-2。滤膜与培养基之间不得有气泡。 图 42-2 从滤膜座上将滤膜转移到 EMB 琼脂平板上及培养后的菌落图 8. 将平板倒置于 37℃下培养 22~24 小时。 9. 挑取符合大肠菌群菌落特征的菌落，进行革兰氏染色、镜检。 （1）深紫黑色，有金属光泽。 （2）紫黑色，不带或略带金属光泽。 （3）淡紫红色，中心颜色较深。 10. 经染色证实为革兰氏阴性无芽孢杆菌者，再接种在乳糖蛋白胨发酵管中，经 37℃培养
6~8小时后观察，产酸又产气者即为大肠菌群阳性。培养中应及时观察，时间过长则气泡可能消失。11.计算1升水样中的大肠菌群数=滤膜上的大肠菌群菌落数×10四、实验报告1.根据你所做的实验结果，描写滤膜上的大肠菌群菌落的外观。2.滤膜上的大肠菌群菌落数.03.1L水样中的大肠菌群数五、问题和思考应用滤膜法除了可以检查水中细菌以外，还可以应用于微生物学的哪些方面？试举一例说明。117
117 6~8 小时后观察，产酸又产气者即为大肠菌群阳性。培养中应及时观察，时间过长则气泡可能消 失。 11. 计算 1 升水样中的大肠菌群数=滤膜上的大肠菌群菌落数×10 四、 实验报告 1. 根据你所做的实验结果，描写滤膜上的大肠菌群菌落的外观。 2. 滤膜上的大肠菌群菌落数 。 3. 1L 水样中的大肠菌群数 。 五、 问题和思考 应用滤膜法除了可以检查水中细菌以外，还可以应用于微生物学的哪些方面？试举一例说 明