实验四十四营养缺陷型的筛选和鉴定一、实验目的和内容目的：学习营养缺陷型的筛选和鉴定方法：了解营养缺陷型在生命科学研究中的应用。内容：1.细胞或分子孢子的诱变处理。2．营养缺陷型的浓缩。3.营养缺陷型的挑出。4.营养缺陷型的鉴定。二、实验材料和用具大肠杆菌（E.coli）斜面菌种。细菌基本培养基、LB培养基（固体和液体）、PB缓冲液（pH7.0）、氨苄青霉素、氨基酸、碱基混合物、维生素混合物。台式离心机、多用振荡器、磁力搅拌器、紫外灯（30W）、离心机、各种试管、培养皿、三角瓶、接种环、酒精灯、无菌牙签、涂布器。三、操作步骤（一）细菌悬液的制备取一环Ecoli斜面菌种划线接种在LB固体平板上，37℃培养12~16h挑取单菌落接入装有3mlLB液体培养基的试管中，37℃200r/min培养12~16h，取此培养液0.5ml接入含有50mlLB液体培养基的250ml三角瓶中。37℃200r/min培养2~4h（培养至对数期），将培养液离心（3000r/min，10min）弃上清，菌体用PB离心洗涤两次（离心条件同前），最后用PB悬浮细胞，菌落计数器计数，使细胞浓度控制在10~10°/ml。（二）诱变处理取上述菌悬液2ml于小培养血（直径6cm，内含搅拌子）中，将培养血放置在磁力搅拌器上，在搅拌状态下接受紫外照射2~5min（紫外灯30W，距离30cm），照射完毕立即离心，收集细胞，并避光保存。（三）营养缺陷型的浓缩将上述诱变处理过的细菌细胞接入含有50mlLB培养基的250ml三角瓶中，37℃200r/min培养2~4h，离心收集细胞，并用基本培养基洗涤两次，用4ml基本培养基悬浮细胞，取2ml细胞悬液接入50ml含有氨苄青霉素（终浓度20~60μg/ml）的基本培养基中，37℃200r/min培养3~4h，121
121 实验四十四 营养缺陷型的筛选和鉴定 一、实验目的和内容 目的：学习营养缺陷型的筛选和鉴定方法；了解营养缺陷型在生命科学研究中的应用。 内容：1. 细胞或分子孢子的诱变处理。 2. 营养缺陷型的浓缩。 3. 营养缺陷型的挑出。 4. 营养缺陷型的鉴定。 二、实验材料和用具 大肠杆菌（E.coli）斜面菌种。 细菌基本培养基、LB 培养基（固体和液体）、PB 缓冲液（pH7.0）、氨苄青霉素、氨基酸、碱 基混合物、维生素混合物。 台式离心机、多用振荡器、磁力搅拌器、紫外灯（30W）、离心机、各种试管、培养皿、三角 瓶、接种环、酒精灯、无菌牙签、涂布器。 三、操作步骤 （一） 细菌悬液的制备 取一环 E.coli 斜面菌种划线接种在 LB 固体平板上，37℃培养 12~16h 挑取单菌落接入装有 3mlLB 液体培养基的试管中，37℃200r/min 培养 12~16h，取此培养液 0.5ml 接入含有 50mlLB 液 体培养基的 250ml 三角瓶中。37℃200r/min 培养 2~4h（培养至对数期），将培养液离心 （3000r/min,10min）弃上清，菌体用 PB 离心洗涤两次（离心条件同前），最后用 PB 悬浮细胞， 菌落计数器计数，使细胞浓度控制在 107 ~108 /ml。 （二）诱变处理 取上述菌悬液 2ml 于小培养皿（直径 6cm，内含搅拌子）中，将培养皿放置在磁力搅拌器上， 在搅拌状态下接受紫外照射 2~5min（紫外灯 30W，距离 30cm），照射完毕立即离心，收集细胞， 并避光保存。 （三）营养缺陷型的浓缩 将上述诱变处理过的细菌细胞接入含有 50mlLB 培养基的 250ml 三角瓶中，37℃200r/min 培 养 2~4h，离心收集细胞，并用基本培养基洗涤两次，用 4ml 基本培养基悬浮细胞，取 2ml 细胞 悬液接入 50ml 含有氨苄青霉素（终浓度 20~60μg/ml）的基本培养基中，37℃200r/min 培养 3~4h
离心，取沉淀，用PB洗涤两次后用PB制成细胞悬液，并用PB适当稀释，取100~200uL稀释液涂LB固体平板，37℃培养12~16h。（四）营养缺陷型的挑出将LB平板上形成的每个菌落用无菌牙签分别点种在基本培养基和LB固体培养基的相应位置上，37℃培养12~16h。将在LB培养基上生长而在基本培养基上不生长的菌落继续接种在基本培养基和LB培养基的对应位置上，如此传代5~6次，最后在LB上生长而在基本培养基相应位置上不生长的菌落即可确定为营养缺陷型菌株。（五）营养缺陷型的鉴定把挑出的缺陷型用PB悬浮制成菌悬液（10~10/m1），取100~200μL涂布在固体基本培养基的表面，待表面干燥后，在标定位置上放置少量氨基酸、碱基或维生素的结晶（或滤纸片），37℃培养12~16h。缺陷型在所需的化合物周围出现混浊的生长圈。现一般把几种化合物编为一组，按表44-1进行测定：表44-1营养缺陷型检测分组表组别化合物代号7A18910117B2121314153816c121718D4913161920E51014171921F61115182021按上表可在一个培养血上测定出一个营养缺陷型菌株对21种化合物的需要情况。如若在放有C组化合物的周围出现生长圈，则这一缺陷型少化合物3。如若在C组和D组位置周围都出现生长，则这一缺陷型所需要的化合物是16。如若在C组和D组之间出现生长，说明这一缺陷型同时需要C.D.这两组化合物中的各一种，具体是哪两种，尚需进一步鉴定。四、注意事项1．紫外诱变后要避光培养。2.操作的各个环节要无菌操作。五、实验报告1.绘制营养缺陷型挑选的流程简图。2.试述营养缺陷型浓缩的机理是什么。六、问题和思考122
122 离心，取沉淀，用 PB 洗涤两次后用 PB 制成细胞悬液，并用 PB 适当稀释，取 100~200μL 稀释液 涂 LB 固体平板，37℃培养 12~16h。 （四）营养缺陷型的挑出 将 LB平板上形成的每个菌落用无菌牙签分别点种在基本培养基和 LB固体培养基的相应位置 上，37℃培养 12~16h。将在 LB 培养基上生长而在基本培养基上不生长的菌落继续接种在基本培 养基和 LB 培养基的对应位置上，如此传代 5~6 次，最后在 LB 上生长而在基本培养基相应位置上 不生长的菌落即可确定为营养缺陷型菌株。 （五）营养缺陷型的鉴定 把挑出的缺陷型用 PB 悬浮制成菌悬液（106 ~108 /ml），取 100~200μL 涂布在固体基本培养 基的表面，待表面干燥后，在标定位置上放置少量氨基酸、碱基或维生素的结晶（或滤纸片）， 37℃培养 12~16h。缺陷型在所需的化合物周围出现混浊的生长圈。现一般把几种化合物编为一 组，按表 44-1 进行测定： 表 44-1 营养缺陷型检测分组表 组 别 化合物代号 A 1 7 8 9 10 11 B 2 7 12 13 14 15 C 3 8 12 16 17 18 D 4 9 13 16 19 20 E 5 10 14 17 19 21 F 6 11 15 18 20 21 按上表可在一个培养皿上测定出一个营养缺陷型菌株对 21 种化合物的需要情况。如若在放 有 C 组化合物的周围出现生长圈，则这一缺陷型少化合物 3。如若在 C 组和 D 组位置周围都出现 生长，则这一缺陷型所需要的化合物是 16。如若在 C 组和 D 组之间出现生长，说明这一缺陷型 同时需要 C.D.这两组化合物中的各一种，具体是哪两种，尚需进一步鉴定。 四、注意事项 1. 紫外诱变后要避光培养。 2. 操作的各个环节要无菌操作。 五、实验报告 1. 绘制营养缺陷型挑选的流程简图。 2. 试述营养缺陷型浓缩的机理是什么。 六、问题和思考
1.营养缺陷型挑选时应注意哪些问题？2．试设计一实验，如何获得Aspergillusniger的营养缺陷型。3.试设计一实验，如何能获得E.coli的丙氨酸营养缺陷型（ala-），123
123 1. 营养缺陷型挑选时应注意哪些问题？ 2. 试设计一实验，如何获得 Aspergillus niger 的营养缺陷型。 3. 试设计一实验，如何能获得 E.coli 的丙氨酸营养缺陷型（ala-）