实验四十五有机污染物质的生物降解实验一、实验目的与内容1、掌握微生物在环境污染物降解中的原理和重要作用。2、掌握污染物测定的测定方法。二、实验原理有机污染物广泛存在自然环境中，绝大多数污染物可以在微生物的作用下被降解，本实验以表面表面活性剂为模式有机污泥物进行生物降解实验。表面表面活性剂是合成洗涤剂的主要有效成分，目前应用较多的是直链型烷基苯磺酸盐类（LAS）。环境中表面活性剂的消失几乎全靠微生物的作用，微生物通过其特殊的酶系的降解能力受到菌株类型、表面活性剂浓度及其他多种物理化学因素的影响。本实验应用一株由处理洗涤剂工业废水的塔式生物滤池中分离得到的LAS降解菌，考查不同起始浓度LAS对微生物降解度的影响。三、实验材料和用具1.菌种：气单胞菌D-4(Aeromonassp.D-4，由中国科学院水生生物研究所提供）2.培养基合成洗涤剂（含LAS）：0.02-0.12%；蛋白陈：0.5%；NaC1：0.5%；NHNO3：0.5%KHPO%0.1%；KzHP04：0.1%蒸馏水：100ml。调节pH至6.7-7.2，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。分别配制四种含不同LAS浓度的培养液，使其LAS含量为40、120、180及240mg/L。可根据所采用的洗涤剂型号中LAS含量换算，再经实测。培养液分装于500ml三角瓶，每瓶注100ml不同LAS浓度标记清楚，121℃高压蒸汽灭菌20分钟备用。3.美蓝溶液：称取100mg美蓝溶于蒸馏水后稀释至100ml。移取该液30ml于1000ml容量瓶中，加6.8ml分析纯浓HS0及50gNaHP02H0，用蒸馏水溶解后加入容量瓶并稀释至1000ml刻度处。4.LAS标准溶液：称取纯LAS0.5g（99.5%LAS标准品可由上海有机化学研究所提供），溶于蒸馏水，稀释至500ml，此液LAS浓度为1mg/ml。取此液10ml稀释至1000ml，则LAS浓度为0.01mg/ml。5.洗涤液：取6.8ml分析纯浓H2S0及50gNaHP0k·2H20，溶于蒸馏水并稀释至1000ml。6.仪器恒温振荡器、分光光度计（具波长652nm）、离心机、500ml三角瓶、250ml分液漏斗、50、100、500及1000ml容量瓶、量筒、吸管、脱脂棉等。四、操作步骤1.接种：取气菌株斜面菌种1支，以10ml无菌水洗下菌苔，充分摇匀打散，制成浓菌液。每瓶培养液中接入菌液1ml；每种LAS浓度接2瓶，另设1瓶不接种作对照。124
124 实验四十五 有机污染物质的生物降解实验 一、实验目的与内容 1、掌握微生物在环境污染物降解中的原理和重要作用。 2、掌握污染物测定的测定方法。 二、实验原理 有机污染物广泛存在自然环境中，绝大多数污染物可以在微生物的作用下被降解，本实验以 表面表面活性剂为模式有机污泥物进行生物降解实验。表面表面活性剂是合成洗涤剂的主要有效 成分，目前应用较多的是直链型烷基苯磺酸盐类(LAS)。环境中表面活性剂的消失几乎全靠微生 物的作用，微生物通过其特殊的酶系的降解能力受到菌株类型、表面活性剂浓度及其他多种物理 化学因素的影响。本实验应用一株由处理洗涤剂工业废水的塔式生物滤池中分离得到的 LAS 降解 菌，考查不同起始浓度 LAS 对微生物降解度的影响。 三、实验材料和用具 1.菌种：气单胞菌 D-4(Aeromonas sp．D-4，由中国科学院水生生物研究所提供) 2.培养基 合成洗涤剂（含 LAS）：0.02-0.12%；蛋白胨：0.5%；NaCl：0.5%；NH4NO3：0.5%；KH2PO4： 0.1%；K2HPO4：0.1%；蒸馏水：100ml。调节 pH 至 6.7-7.2，121℃高压蒸汽灭菌 20 分钟。 分别配制四种含不同 LAS 浓度的培养液，使其 LAS 含量为 40、120、180 及 240mg/L。可根 据所采用的洗涤剂型号中 LAS 含量换算，再经实测。培养液分装于 500ml 三角瓶，每瓶注 100ml， 不同 LAS 浓度标记清楚，121℃高压蒸汽灭菌 20 分钟备用。 3．美蓝溶液：称取 100 mg 美蓝溶于蒸馏水后稀释至 100ml。移取该液 30ml 于 1000ml 容量 瓶中，加 6.8ml 分析纯浓 H2SO4及 50g NaH2PO4·2H2O, 用蒸馏水溶解后加入容量瓶并稀释至 1000ml 刻度处。 4．LAS 标准溶液：称取纯 LAS 0.5g(99.5%LA S 标准品可由上海有机化学研究所提供)，溶 于蒸馏水，稀释至 500ml，此液 LAS 浓度为 1mg/ml。取此液 10ml 稀释至 1000ml,则 LAS 浓度为 0.01mg/ml。 5．洗涤液：取 6.8ml 分析纯浓 H2SO4及 50g NaH2PO4·2H2O ,溶于蒸馏水并稀释至 1000ml。 6．仪器 恒温振荡器、分光光度计(具波长 652nm)、离心机、500ml 三角瓶、250ml 分液漏斗、50、 100、500 及 1000ml 容量瓶、量筒、吸管、脱脂棉 等。 四、操作步骤 1．接种：取气菌株斜面菌种 1 支，以 10ml 无菌水洗下菌苔，充分摇匀打散，制成浓菌液。 每瓶培养液中接入菌液 1ml；每种 LAS 浓度接 2 瓶，另设 1 瓶不接种作对照
2.培养：将接种与不接种之对照瓶置震荡器上，控制转速为170-220r/min，手321C恒温震荡培养48小时。培养结实时，将培养液离心以除去菌体（8000r/min离心10分钟或4000r/min离心30分钟。离心后之上清液留作测定LAS用。3.LAS测定：LAS和美蓝可生成蓝色化合物，并溶于氯仿等有机溶剂中。(1)制备标准曲线：取0、2、5、10、15、20mlLAS标准液（0.01mg/m1)分别稀释至100ml制成不同浓度标准液。将标准液100ml装于250ml分液漏斗中，用H2S04调节pH至微酸性，加美蓝液25ml。①氯仿提取：向上述分液漏斗中加氯仿10m1，猛烈振荡30秒钟，静置分层，将氯仿层排入另一个250ml分液漏斗中。如此提取三次。②洗涤：在上述接纳了三次氯仿提取液的分液漏斗中加入50m1洗涤液，猛烈振荡30秒钟，静置分层。将一小块脱脂棉塞入分液漏斗活塞下部以滤除水珠，分液漏斗中的氯仿层缓缓放下至一个50ml容量瓶中。③再次提取：加氯仿6m1于上述②分液漏斗的水液中，振荡分层后将氯仿层并入上述②容量瓶中。如此提取三次。然后用氯仿将容量瓶中液体稀释至50m1刻度处。测定LAS：用纯氯仿做空白对熙，用分光光度计固定波长为652nm，测定各标准液的光密度值（OD)。以光密度值作纵坐标，LAS的毫克数（LAS原标准液浓度0.01mg/ml×所取该液的ml数）作横坐标，制取标准曲线。并通过图解法求出标准曲线的斜率K。(2)培养液测定：吸取离心后的培养液上清液1-10ml，放于250ml分液漏斗中，用蒸馏水稀释至100m1。以下步骤同绘制标准曲线时的步骤，测得样品的氯仿提取液之光密度值。按下式计算样品中LAS浓度。LAS（mg/L）=0D652X1000/（标准曲线斜率×水样体积）×100%4.LAS降解度计算D=（Ca—C）/Co×100%D：降解度%Co：振荡培养开始时的起始LAS浓度(mg/L)C：：振荡培养若干小时后的残留LAS浓度（mg/L）如果未接菌液的空白对照液经培养后，LAS也有所减少，且其差值为C（mg/L)，则D=(Co—(C++C))/C0X100%五、实验报告将实验结果填入下表。表45-1LAS起始浓度对微生物降解度的影响40120180240起始LAS浓度（mg/L）接种不接种接种中不接种接种不接种接种不接种培养后残留LAS浓度降解度（%）125
125 2．培养：将接种与不接种之对照瓶置震荡器上，控制转速为 170-220r/min，于 32±1℃恒 温震荡培养 48 小时。培养结实时,将培养液离心以除去菌体(8000r/min 离心 10 分钟或 4000r/min 离心 30 分钟)。离心后之上清液留作测定 LAS 用。 3．LAS 测定：LAS 和美蓝可生成蓝色化合物，并溶于氯仿等有机溶剂中。 (1)制备标准曲线：取 0、2、5、10、15、20 ml LAS 标准液(0.01mg/m1)分别稀释至 100 ml 制成不同浓度标准液。将标准液 100ml 装于 250 m1 分液漏斗中，用 H2S04 调节 pH 至微酸性，加 美蓝液 25ml。 ① 氯仿提取：向上述分液漏斗中加氯仿 10ml，猛烈振荡 30 秒钟，静置分层，将氯仿层排 入另一个 250m1 分液漏斗中。如此提取三次。 ② 洗涤：在上述接纳了三次氯仿提取液的分液漏斗中加入 50ml 洗涤液，猛烈振荡 30 秒钟， 静置分层。将一小块脱脂棉塞入分液漏斗活塞下部以滤除水珠，分液漏斗中的氯仿层缓缓放下至 一个 50 ml 容量瓶中。 ③ 再次提取：加氯仿 6ml 于上述②分液漏斗的水液中,振荡分层后将氯仿层并入上述②容量 瓶中。如此提取三次。然后用氯仿将容量瓶中液体稀释至 50ml 刻度处。 ④ 测定 LAS：用纯氯仿做空白对熙，用分光光度计固定波长为 652nm，测定各标准液的光密 度值(OD)。以光密度值作纵坐标，LAS 的毫克数(LAS 原标准液浓度 0.01mg/ml×所取该液的 ml 数)作横坐标，制取标准曲线。并通过图解法求出标准曲线的斜率 K。 (2)培养液测定：吸取离心后的培养液上清液 1-10ml，放于 250m1 分液漏斗中，用蒸馏水稀 释至 100ml。以下步骤同绘制标准曲线时的步骤，测得样品的氯仿提取液之光密度值。按下式计 算样品中 LAS 浓度。 LAS(mg/L)＝OD652×1000/（标准曲线斜率×水样体积）×100% 4．LAS 降解度计算 D＝（C0－Ct）/C0×100% D：降解度% C0：振荡培养开始时的起始 LAS 浓度(mg/L) Ct:：振荡培养若干小时后的残留 LAS 浓度(mg/L) 如果未接菌液的空白对照液经培养后，LAS 也有所减少，且其差值为 C(mg/L)，则 D＝｛C0－(Ct+C)｝/C0×100% 五、实验报告 将实验结果填入下表。 表 45-1 LAS 起始浓度对微生物降解度的影响 40 120 180 240 起始 LAS 浓度（mg/L） 接种 不接种 接种 不接种 接种 不接种 接种 不接种 培养后残留 LAS 浓度 降解度（%）
六、问题和思考1.实验结果说明了什么问题？2．参考本实验设计一个污染物微生物降解实验（要求有污染物的测定方法）。126
126 六、问题和思考 1．实验结果说明了什么问题？ 2．参考本实验设计一个污染物微生物降解实验（要求有污染物的测定方法）