第三部分综合设计性实验实验四十三微生物的诱变育种一、实验目的和内容目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本操作方法。内容：1．对米曲霉（Aspergillsoryzae）出发菌株进行处理，制备孢子悬液。2.用紫外线进行诱变处理。3.用平板透明圈法进行两次初筛。4.用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。二、实验材料和用具米曲霉斜面菌种。豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白。三角瓶（300ml、500ml）、试管、培养血（9cm）、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。三、操作步骤（一）出发菌株的选择及菌悬液制备1.出发菌株的选择可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。2.菌悬液制备取出发菌株转接至豆饼斜面培养集中，30℃培养3~5d活化。然后把孢子洗至装有100m10.1mo1/LpH6.0的磷酸缓冲液的三角瓶中（内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜）30℃振荡30min，用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成孢子悬液，调其浓度为10~10°个/ml，冷冻保存备用。（二）诱变处理可用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。1.紫外线处理打开紫外灯（30W）预热20min。取5ml菌悬液放在无菌的培养皿（9cm）中，同时制作5份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯30cm（垂直距离）处的磁力搅拌器上，照射1min后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时118
118 第三部分 综合设计性实验 实验四十三 微生物的诱变育种 一、 实验目的和内容 目的：以紫外线诱变获得用于酱油生产的高产蛋白酶菌株为例，学习微生物诱变育种的基本 操作方法。 内容：1. 对米曲霉（Aspergills oryzae）出发菌株进行处理，制备孢子悬液。 2. 用紫外线进行诱变处理。 3. 用平板透明圈法进行两次初筛。 4. 用摇瓶法进行复筛及酶活性测定。 二、 实验材料和用具 米曲霉斜面菌种。 豆饼斜面培养基、酪素培养基、蒸馏水、0.5%酪蛋白。 三角瓶（300ml、500ml）、试管、培养皿（9cm）、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁 力搅拌器、脱脂棉、无菌漏斗、玻璃珠、移液管、涂布器、酒精灯。 三、 操作步骤 （一）出发菌株的选择及菌悬液制备 1. 出发菌株的选择 可直接选用生产酱油的米曲霉菌株，或选用高产蛋白酶的米曲霉菌株。 2. 菌悬液制备 取出发菌株转接至豆饼斜面培养集中，30℃培养 3~5d 活化。然后把孢子洗 至装有 100ml0.1mol/LpH6.0 的磷酸缓冲液的三角瓶中（内装玻璃珠，装量以大致铺满瓶底为宜）， 30℃振荡 30min,用垫有脱脂棉的灭菌漏斗过滤，制成孢子悬液，调其浓度为 106 ~108 个/ml,冷冻 保存备用。 （二）诱变处理 可用物理方法或化学方法，所用诱变剂种类及剂量的选择可视具体情况决定，有时还可采用 复合处理，可获得更好的结果。本实验学习用紫外线照射的诱变方法。 1. 紫外线处理 打开紫外灯（30W）预热 20min。取 5ml 菌悬液放在无菌的培养皿（9cm） 中，同时制作 5 份。逐一操作，将培养皿平放在离紫外灯 30cm（垂直距离）处的磁力搅拌器上， 照射 1min 后打开培养皿盖，开始照射，与照射处理开始的同时打开磁力搅拌器进行搅拌，即时
计算时间，照射时间分别为15s、30s、1min、2min、5min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1~2h，然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。2稀释菌悬液按10被稀释至10″，从10和10中各取出0.1ml加入到酪素培养基平板中（每个稀释度均做3个重复），然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于30℃恒温培养2~3d。（三）优良菌株的筛选1．初筛首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比，选择其比值大且菌落直径也大的菌落40~50个，作为复筛菌株。2．平板复筛分别倒酪素培养基平板，在每个平血的背面用红笔划线分区，从圆心划线至周边分成8等份，1~7份中点种初筛菌株，第8份点种原始菌株，作为对照。培养48h后即可见生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进入摇瓶复筛阶段。3.摇瓶复筛将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦麸85g，豆饼粉（或面粉）15g，加水95~110mL（称为润水），水含量以手捏后指缝有水而不下滴为宜，于500mL三角瓶中装入15~20g（料厚为1~1.5cm），121℃湿热灭菌30min，然后分别接入以上初筛获得的优良菌株，30℃培养，24h后摇瓶一次并均匀铺开，再培养24~48h，共培养3~5d后检测蛋白酶活性。4.蛋白酶的测定方法（1）取样：培养后随机称取以上摇瓶培养物1g，加蒸馏水100ml（或200ml），40℃水浴，浸酶1h，取上清浸液测定酶活性。另取1g培养物于105℃烘干测定含水量。（2）酶活性测定：30℃pH7.5条件下水解酪蛋白（底物为0.5%酪蛋白），每分钟产酪氨酸1g为一个酶活力单位。计算公式为：（A样品ODao0m值-A对照ODes0mm值）XKXV/tXNK：标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数V：酶促反应的总体积；t：酶促反应时间（min)：N：酶的稀释倍数。5.谷氨酸的检测此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。检测培养基：豆饼粉：麦麸=6：4，润水75%，121℃湿热灭菌30min。谷氨酸测定：于以上培养基中加入7%盐水（W/V），40~45℃水浴，水解9d后过滤，以滤液检测谷氨酸含量（测压法）。119
119 计算时间，照射时间分别为 15s、30s、1min、2min、5min。照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保 存 1~2h，然后在红灯下稀释涂菌进行初筛。 2. 稀释菌悬液 按 10 被稀释至 10-6，从 10-5和 10-6中各取出 0.1ml 加入到酪素培养基平板 中（每个稀释度均做 3 个重复），然后涂菌并静置，待菌液渗入培养基后倒置，于 30℃恒温培养 2~3d。 （三）优良菌株的筛选 1. 初筛 首先观察在菌落周围出现的透明圈大小，并测量其菌落直径与透明圈直径之比， 选择其比值大且菌落直径也大的菌落 40~50 个，作为复筛菌株。 2. 平板复筛 分别倒酪素培养基平板，在每个平皿的背面用红笔划线分区，从圆心划线至 周边分成 8 等份，1~7 份中点种初筛菌株，第 8 份点种原始菌株，作为对照。培养 48h 后即可见 生长，若出现明显的透明圈，即可按初筛方法检测，获得数株二次优良菌株，进入摇瓶复筛阶段。 3. 摇瓶复筛 将初筛出的菌株，接入米曲霉复筛培养基中进行培养，其方法是，称取麦麸 85g，豆饼粉（或面粉）15g，加水 95~110mL(称为润水)，水含量以手捏后指缝有水而不下滴为 宜，于 500mL 三角瓶中装入 15~20g（料厚为 1~1.5cm）,121℃湿热灭菌 30min，然后分别接入以 上初筛获得的优良菌株，30℃培养，24h 后摇瓶一次并均匀铺开，再培养 24~48h，共培养 3~5d 后检测蛋白酶活性。 4. 蛋白酶的测定方法 （1）取样：培养后随机称取以上摇瓶培养物 1g，加蒸馏水 100ml（或 200ml），40℃水浴， 浸酶 1h，取上清浸液测定酶活性。另取 1g 培养物于 105℃烘干测定含水量。 （2）酶活性测定：30℃pH7.5 条件下水解酪蛋白（底物为 0.5%酪蛋白），每分钟产酪氨酸 1 μg 为一个酶活力单位。计算公式为： （A 样品 OD680nm值-A 对照 OD680nm值）×K×V/t×N K:标准曲线中光吸收为“1”时的酪氨酸微克数； V：酶促反应的总体积； t：酶促反应时间（min）； N：酶的稀释倍数。 5. 谷氨酸的检测 此项检测也是酱油优良菌株的重要指标之一。 检测培养基：豆饼粉:麦麸=6:4，润水 75%，121℃湿热灭菌 30min。 谷氨酸测定：于以上培养基中加入 7%盐水（W/V），40~45℃水浴，水解 9d 后过滤，以滤液 检测谷氨酸含量（测压法）
四、注意事项1.紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。2.诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。五、实验报告1.试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果2．你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进？六、问题和思考1.试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。2.为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间？120
120 四、 注意事项 1. 紫外线照射时注意保护眼睛和皮肤。 2. 诱变过程及诱变后的稀释操作均在红灯下进行，并在黑暗中培养。 五、 实验报告 1. 试列表说明高产蛋白酶菌株的筛选过程和结果。 2. 你认为以上的筛选方法有什么优缺点，如何改进？ 六、 问题和思考 1. 试述紫外线诱变的作用机理及其在具体操作中应注意的问题。 2. 为什么在诱变前要把菌悬液打散和培养一段时间？