实验四十六双歧杆菌酸口服液的发酵制备一、实验目的和内容1.学习分离和纯化菌株的方法。2．学习营养口服液的制作方法及过程。3．初步了解食品药品生产时的管理规定和技术标准。二、实验原理双歧杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌等对人体有明显有营养保健作用，是微生态试剂的重要生产菌株。双歧杆菌是一种厌氧菌和微好氧菌株，它对生存环境的要求非常苛刻，易受氧、水分、光线、保护基质等条件的影响。微好氧菌株经过驯化，能承受一定氧压，既有利于生产，又能促进正常菌群生长和繁殖。在西红柿和豆粕煮汁中等中含有小分子蛋白、双歧杆菌生长因子和低聚糖等物质，能选择性增殖双歧杆菌。乳酸杆菌和乳酸球菌产酸快，从而为双歧杆菌提供较低的pH值环境，对它的生长繁殖有促进作用，因此选择乳酸杆菌和乳酸球菌作辅助发酵菌株。与此同时双歧杆菌代谢后会产生醋酸及乳酸，使培养液呈酸性，虽能抑制有害菌的生殖，但如果pH值过分降低也使菌体其自身受到酸性的影响，因此在含活菌的活性营养口服液中大多添加磷酸盐等缓冲物质，防止pH过分偏低，延长产品中活菌的保持期并保持其保健作用。三、实验材料和用具1.菌种：双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌由本实验室筛选，经权威部门鉴定符合生产和临床使用标准。2.培养基：（1）改良TJA培养基（培养双歧杆菌用）：番茄汁50mL；酵母浸出物5g；肉育10g；乳糖20g：葡萄糖2g；K2HP02g：Tween801g醋酸钠2.5g；琼脂15g。（2）BL培养基（培养乳酸菌用）：番茄汁400mL；蛋白陈15g：酵母浸膏6g：肝浸液45mL；葡萄糖20g：可溶性淀粉0.5g；NaC15g；Tween803ml；L-Cys0.5g；蒸馏水1000mL；pH7.2。（3）去脂TJA培养基：在改良TJA培养基配方的基础上减去琼脂。（4）发酵培养基（生产发酵液）：番茄汁1ml：酵母浸出物1g：乳糖1g；葡萄糖1gKeHP00.1gTween800.1ml；3%豆粘浸汁100ml。灭菌温度在115℃，时间20min3.青春型双歧杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌的发酵菌种：试管斜面一→转种50mL试管一→250mL三角瓶一→测定菌量、酸度和pH值。液体接种量为3%，摇床振荡培养。四操作步骤1、菌株活化及发酵剂制作（1）倒平板培养基：将改良TJA培养基完全融化并冷却至45℃左右倒平板，冷凝待用。127
127 实验四十六 双歧杆菌酸口服液的发酵制备 一、实验目的和内容 1. 学习分离和纯化菌株的方法。 2．学习营养口服液的制作方法及过程。 3．初步了解食品药品生产时的管理规定和技术标准。 二、实验原理 双歧杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌等对人体有明显有营养保健作用，是微生态试剂的重要生产 菌株。双歧杆菌是一种厌氧菌和微好氧菌株，它对生存环境的要求非常苛刻，易受氧、水分、光 线、保护基质等条件的影响。微好氧菌株经过驯化，能承受一定氧压，既有利于生产，又能促进 正常菌群生长和繁殖。在西红柿和豆粕煮汁中等中含有小分子蛋白、双歧杆菌生长因子和低聚糖 等物质，能选择性增殖双歧杆菌。乳酸杆菌和乳酸球菌产酸快，从而为双歧杆菌提供较低的 pH 值环境，对它的生长繁殖有促进作用，因此选择乳酸杆菌和乳酸球菌作辅助发酵菌株。 与此同时双歧杆菌代谢后会产生醋酸及乳酸，使培养液呈酸性，虽能抑制有害菌的生殖，但 如果 pH 值过分降低也使菌体其自身受到酸性的影响，因此在含活菌的活性营养口服液中大多添 加磷酸盐等缓冲物质，防止 pH 过分偏低，延长产品中活菌的保持期并保持其保健作用。 三、实验材料和用具 1．菌种： 双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌由本实验室筛选，经权威部门鉴定符合生产和临床使用标准。 2．培养基： （1）改良 TJA 培养基（培养双歧杆菌用）：番茄汁 50mL；酵母浸出物 5g；肉膏 lOg；乳糖 20g；葡萄糖 2g；K2HPO4 2g；Tween80 1g；醋酸钠 2.5g；琼脂 15g。 （2）BL 培养基（培养乳酸菌用）：番茄汁 400mL；蛋白胨 15g；酵母浸膏 6g；肝浸液 45 mL； 葡萄糖 20g；可溶性淀粉 0.5g； NaCl5g；Tween80 3ml；L-Cys 0.5 g；蒸馏水 1000mL；pH7.2。 （3）去脂 TJA 培养基：在改良 TJA 培养基配方的基础上减去琼脂。 （4）发酵培养基(生产发酵液)：番茄汁 1 ml；酵母浸出物 1g；乳糖 1g；葡萄糖 1g；K2HPO4 0.1g；Tween80 0.1ml；3%豆粕浸汁 100ml。灭菌温度在 115℃，时间 20min。 3．青春型双歧杆菌、乳酸杆菌和乳酸球菌的发酵菌种： 试管斜面—→转种 50 mL 试管—→250mL 三角瓶—→测定菌量、酸度和 pH 值。 液体接种量为 3%，摇床振荡培养。 四 操作步骤 1、菌株活化及发酵剂制作 (1) 倒平板培养基：将改良 TJA 培养基完全融化并冷却至 45℃左右倒平板，冷凝待用
（2）分离纯化及活化：用接种环分别在双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌斜面上挑取少许菌株作平板划线分离。分离后，放37℃下培养以获得单菌落。（3）观察菌落特征：经2-3天培养，待菌落长成后，应仔细观察并区别不同类型的菌，注意是否有污染。青春型双歧杆菌在培养基平板表面常呈现的形态菌落特征：大小为2-3mm，菌落中央呈隆起状，边缘整齐，半透明状，有浓郁的醋酸味，染色镜检为短杆状。乳酸菌在BL培养基平板表面常呈现三种形态特征的菌落：①扁平型菌落：大小为2-3mm，边缘不整齐，很薄，近似透明状，染色镜检为杆状：②半球状隆起菌落：大小为1-2mm，隆起成半球状，高约0.5mm，边缘整齐且四周可见酪蛋白水解透明圈，染色镜检为链球状；礼帽形突起菌落：大小为1-2mm，边缘基本整齐，菌落中央呈隆起状，四周较薄，也有酪蛋白透明圈，染色镜检也呈链球状。（4）挑取少许具有上述菌落特征和菌株，分别接入装有50m1去脂TJA培养基的试管中，37℃C下培养至出现混浊时停止作发酵剂用，如果需用量大可改用发酵罐培养。2.实验流程及注意事项：1）实验流程辅助原料发酵剂1+豆柏煮汁—→调配—→灌装—→高压灭菌—→混合接种—→发酵—→成品2）注意事项①煮汁时一定要控制在90--100℃，时间为1h，不时的搅拌，以免糊化。煮汁一定要细过滤。②双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌的比例为：3：1：1，总接种量为3%。③培养温度控制在37℃，当培养液出现混浊沉淀时，表明此时活菌数很高且大量产酸（此时pH值约4.0），即可终止发酵。④选择优良的发酵剂是产品是否具有保健作用的关键，也是产品能否长期保存期的关键。③辅助原料按发酵培养基（生产发酵液）配方配制，现配现用以防污染；在发酵及传代中应避免杂菌污染。③实际生产时应按国家标准或行业和企业标准组织生产。五、实验报告将双歧杆菌口服液混菌发酵液发酵结果记录于下表中。口感沉淀情况活菌总数pH值口服初步感觉128
128 (2) 分离纯化及活化: 用接种环分别在双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌斜面上挑取少许菌株 作平板划线分离。分离后，放 37℃下培养以获得单菌落。 (3) 观察菌落特征：经 2-3 天培养，待菌落长成后，应仔细观察并区别不同类型的菌，注意 是否有污染。 青春型双歧杆菌在培养基平板表面常呈现的形态菌落特征: 大小为 2-3mm, 菌落中央呈隆 起状，边缘整齐，半透明状，有浓郁的醋酸味，染色镜检为短杆状。 乳酸菌在 BL 培养基平板表面常呈现三种形态特征的菌落: ①扁平型菌落:大小为 2-3mm,边 缘不整齐，很薄，近似透明状，染色镜检为杆状；②半球状隆起菌落:大小为 1-2mm,隆起成半球 状，高约 0.5mm，边缘整齐且四周可见酪蛋白水解透明圈，染色镜检为链球状；③礼帽形突起菌 落:大小为 1-2mm，边缘基本整齐，菌落中央呈隆起状，四周较薄，也有酪蛋白透明圈，染色镜 检也呈链球状。 (4) 挑取少许具有上述菌落特征和菌株，分别接入装有 50ml 去脂 TJA 培养基的试管中，37 ℃下培养至出现混浊时停止作发酵剂用，如果需用量大可改用发酵罐培养。 2．实验流程及注意事项: 1）实验流程 辅助原料 发酵剂 ↓ ↓ 豆粕煮汁—→调配—→灌装—→高压灭菌—→混合接种—→发酵—→成品 2）注意事项 煮汁时一定要控制在 90-100℃，时间为 1h，不时的搅拌，以免糊化。煮汁一定要细过 滤。 双歧杆菌、乳酸杆菌、乳酸球菌的比例为：3:1:1，总接种量为 3%。 培养温度控制在 37℃，当培养液出现混浊沉淀时，表明此时活菌数很高且大量产酸(此 时 pH 值约 4.0)，即可终止发酵。 选择优良的发酵剂是产品是否具有保健作用的关键，也是产品能否长期保存期的关键。 辅助原料按发酵培养基(生产发酵液)配方配制，现配现用以防污染；在发酵及传代中应 避免杂菌污染。 实际生产时应按国家标准或行业和企业标准组织生产。 五、实验报告 将双歧杆菌口服液混菌发酵液发酵结果记录于下表中。 沉淀情况 活菌总数 pH 值 口感 口服初步感觉
六、问题和思考1.在制备保健口服液时，应具备那些条件？2.在制备保健口服液时，应注意那些因素？129
129 六、问题和思考 1．在制备保健口服液时，应具备那些条件？ 2．在制备保健口服液时，应注意那些因素?