实验五、植物原生质体的分离与融合一、实验目的学习植物原生质体分离、纯化与融合的基本原理和实验技术。二、实验原理原生质体是去除细胞壁的裸露细胞。在诱导剂的作用下，不同原生质体可相互粘连，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，最终形成杂种细胞。愈伤组织、悬浮细胞、幼嫩的叶片、子叶、胚轴和花粉四分体等均可作为分离植物原生质体的材料。原生质体的分离常用酶解法，其原理是通过用纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶等配制而成的溶液对细胞壁成分进行降解，从而使原生质体释放出来。原生质体的产率和活力与材料来源及其生理状态、酶液的组成及酶解时间、以及原生质体的收集和纯化方法等有关。酶解液需保持较高的渗透压，以使细胞处于质壁分离状态，利于原生质体分离，并使其在分离后不会因吸胀而破裂。常用甘露醇、山梨醇、葡萄糖或蔗糖作为渗透剂。酶解液中还应加一定量的Ca来稳定质膜。游离出来的原生质体可用过筛一低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯化。纯化的原生质体可用于培养和融合。三、实验用品1、实验材料：前面实验中培养的甜瓜愈伤组织或拟南芥无菌苗叶片。2、仪器设备：离心机、显微镜、pH计、电子天平等。3、器血：300目不锈钢网筛、小烧杯、移液器、吸管、注射器（5mL、10mL）、长针头（12号）、离心管（7mL、10mL）、吸水纸、剪刀、手术刀、镊子等。4、试剂酶液：纤维素酶2%，果胶酶1%，甘露醇0.4mol/L，CaCl2：2H200.05mol/L，MES（2-N-吗啉乙烷磺酸），pH5.8~6.2。0.16mol/LCaCl2·2H20溶液、30%PEG（聚乙二醇，MW6000）溶液、12%蔗糖溶液。四、实验分组1
1 实验五、 植物原生质体的分离与融合 一、实验目的 学习植物原生质体分离、纯化与融合的基本原理和实验技术。 二、实验原理 原生质体是去除细胞壁的裸露细胞。在诱导剂的作用下，不同原生质体可相 互粘连，进而发生膜融合、胞质融合和核融合，最终形成杂种细胞。 愈伤组织、悬浮细胞、幼嫩的叶片、子叶、胚轴和花粉四分体等均可作为分 离植物原生质体的材料。 原生质体的分离常用酶解法，其原理是通过用纤维素酶、果胶酶和半纤维素 酶等配制而成的溶液对细胞壁成分进行降解，从而使原生质体释放出来。原生质 体的产率和活力与材料来源及其生理状态、酶液的组成及酶解时间、以及原生质 体的收集和纯化方法等有关。酶解液需保持较高的渗透压，以使细胞处于质壁分 离状态，利于原生质体分离，并使其在分离后不会因吸胀而破裂。常用甘露醇、 山梨醇、葡萄糖或蔗糖作为渗透剂。酶解液中还应加一定量的 Ca2+来稳定质膜。 游离出来的原生质体可用过筛-低速离心法收集，用蔗糖漂浮法纯化。纯化的原 生质体可用于培养和融合。 三、实验用品 1、实验材料：前面实验中培养的甜瓜愈伤组织或拟南芥无菌苗叶片。 2、仪器设备：离心机、显微镜、pH 计、电子天平等。 3、器皿：300 目不锈钢网筛、小烧杯、移液器、吸管、注射器（5mL、10mL)、 长针头（12 号）、离心管(7mL 、10mL)、吸水纸、剪刀、手术刀、镊子等。 4、试剂 酶液：纤维素酶 2%, 果胶酶 1%，甘露醇 0.4 mol/L，CaCl2﹒2H2O 0.05mol/L， MES（2-N-吗啉乙烷磺酸），pH 5.8~6.2。 0.16mol/L CaCl2﹒2H2O 溶液、30% PEG（聚乙二醇，MW6000）溶液、12% 蔗糖溶 液。 四、实验分组
原生质体分离每8人一组，原生质体融合与观察每4人一组。五、实验方法1、酶液的配制：由实验老师配好。2、愈伤组织/叶片的酶解：取松软愈伤组织/幼叶1~2g，分别放入培养血中切碎，各自转入小烧杯中，然后各加入5~10mL酶液，封口后置于25℃培养箱中酶解6h（遮光）。期间不时摇动小烧杯，以促进酶解和原生质体释放。3、将酶解后的原生质体悬液用300目不锈钢网筛过滤（缓慢，用1mL移液枪轻轻吸打），以除去未完全消化的组织。滤液收入小烧杯中。4、向滤液中加入等体积的0.16moI/LCaCl22H20溶液，轻轻混匀，然后转入7~10mL离心管中，在600rpm离心5min。（此步可省略！）5、小心吸去上清液，用2mL0.16mol/L的CaCl2·2H20溶液悬浮原生质体沉淀（用1mL枪头，动作轻柔，以免损伤原生质体，下同）。6、用长针头注射器向管底缓缓注入12%的蔗糖溶液4mL（此步很关键，应小心操作！后面的步骤应轻拿轻放！)，750rpm离心5min。管底为杂质，在下部蔗糖溶液和上部CaCl2溶液两项界面间应为纯净的原生质体带。7、小心吸去上清液，然后将原生质体部分小心吸出到新的7mL离心管中，加入4mL0.16mo1/L的CaCl2·2H20溶液悬浮原生质体，600rpm离心5min。8、小心吸去大部分上清液，只留少许上清（0.5~1mL）用于悬浮原生质体沉淀。9、原生质体融合：用移液枪分别吸取2种原生质体悬液各1滴于载玻片上，静置10~15min，使原生质体贴附于载玻片上。10、用移液枪吸取30%PEG溶液（40%），等体积缓慢加在原生质体混合液上，静置10-15min后，在显微镜下观察原生质体的粘连、融合情况（10×即可）。（幼嫩的愈伤好！）六、实验报告1、实验目的2、实验原理3、实验步骤（用流程图表示）4、结果与分析部分：1）观察记录密度梯度离心时，原生质体的分带情况，绘图表示。2
2 原生质体分离每 8 人一组，原生质体融合与观察每 4 人一组。 五、实验方法 1、酶液的配制：由实验老师配好。 2、愈伤组织/叶片的酶解：取松软愈伤组织/幼叶 1~2g，分别放入培养皿中切碎， 各自转入小烧杯中，然后各加入 5~10mL 酶液，封口后置于 25℃培养箱中酶解 6 h （遮光）。期间不时摇动小烧杯，以促进酶解和原生质体释放。 3、将酶解后的原生质体悬液用 300 目不锈钢网筛过滤（缓慢，用 1mL 移液枪轻 轻吸打），以除去未完全消化的组织。滤液收入小烧杯中。 4、向滤液中加入等体积的 0.16mol/L CaCl2﹒2H2O 溶液，轻轻混匀，然后转入 7~10 mL 离心管中，在 600 rpm 离心 5min。（此步可省略！） 5、小心吸去上清液，用 2mL 0.16 mol/L 的 CaCl2﹒2H2O 溶液悬浮原生质体沉淀 （用 1mL 枪头，动作轻柔，以免损伤原生质体，下同）。 6、用长针头注射器向管底缓缓注入 12%的蔗糖溶液 4mL（此步很关键，应小心操 作！后面的步骤应轻拿轻放！），750rpm 离心 5min。管底为杂质，在下部蔗糖溶 液和上部 CaCl2溶液两项界面间应为纯净的原生质体带。 7、小心吸去上清液，然后将原生质体部分小心吸出到新的 7 mL 离心管中，加入 4 mL 0.16 mol/L 的 CaCl2﹒2H2O 溶液悬浮原生质体，600rpm 离心 5min。 8、小心吸去大部分上清液，只留少许上清（0.5~1mL）用于悬浮原生质体沉淀。 9、原生质体融合：用移液枪分别吸取 2 种原生质体悬液各 1 滴于载玻片上，静 置 10~15min，使原生质体贴附于载玻片上。 10、用移液枪吸取 30% PEG 溶液（40%），等体积缓慢加在原生质体混合液上，静 置 10-15 min 后，在显微镜下观察原生质体的粘连、融合情况（10×即可）。 （幼嫩的愈伤好！） 六、实验报告 1、实验目的 2、实验原理 3、实验步骤（用流程图表示） 4、结果与分析部分： 1）观察记录密度梯度离心时，原生质体的分带情况，绘图表示
2）观察记录原生质体粘连/融合情况，绘图表示。3）你认为做好这次实验的关键步骤是什么？为什么？2012-5-33
3 2）观察记录原生质体粘连/融合情况，绘图表示。 3）你认为做好这次实验的关键步骤是什么？为什么？ 2012-5-3