附录II试剂和溶液的配制一、3%酸性酒精溶液3ml浓盐酸95%乙醇97ml二、中性红指示剂中性红0.04g95%乙醇28ml蒸馏水72ml中性红pH6.8~8，颜色由红变黄，常用浓度为0.04%。三、淀粉水解试验用碘液（卢戈氏碘液）碘片1g碘化钾2g蒸馏水300ml先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即可。四、溴甲酚紫指示剂溴甲酚紫0. 04g7. 4ml0.01mol/LNaOH蒸馏水92.6ml溴甲酚紫pH5.2~6.8，颜色由黄变紫，常用浓度为0.04%。五、溴麝香草酚蓝指示剂溴麝香草酚蓝0.04g0.01mol/L NaOH6. 4ml蒸馏水93. 6ml溴麝香草酚蓝pH6.0~7.6，颜色由黄变蓝，常用浓度为0.04%。六、甲基红试剂甲基红(Methyl red)0. 04g95%乙醇60ml蒸馏水40ml先将甲基红溶于95%乙醇中，然后加入蒸馏水即可。155
155 附录Ⅲ 试剂和溶液的配制 一、3%酸性酒精溶液 浓盐酸 3ml 95%乙醇 97ml 二、中性红指示剂 中性红 0.04g 95%乙醇 28ml 蒸馏水 72ml 中性红 pH6.8~8，颜色由红变黄，常用浓度为 0.04%。 三、淀粉水解试验用碘液(卢戈氏碘液) 碘片 1g 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml 先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分即可。 四、溴甲酚紫指示剂 溴甲酚紫 0.04g 0.01mol/L NaOH 7.4ml 蒸馏水 92.6ml 溴甲酚紫 pH5.2~6.8，颜色由黄变紫，常用浓度为 0.04%。 五、溴麝香草酚蓝指示剂 溴麝香草酚蓝 0.04g 0.01mol/L NaOH 6.4ml 蒸馏水 93.6ml 溴麝香草酚蓝 pH6.0~7.6，颜色由黄变蓝，常用浓度为 0.04%。 六、甲基红试剂 甲基红(Methyl red) 0.04g 95%乙醇 60ml 蒸馏水 40ml 先将甲基红溶于 95%乙醇中，然后加入蒸馏水即可
七、V.P.试剂1.5%α-萘酚无水乙醇溶液a-萘酚5g无水乙醇100ml2.40%K0H溶液KOH40g蒸馏水100ml八、吲哚试剂2g对二甲基氨基苯甲醛95%乙醇190ml浓盐酸40ml九、格里斯氏(Griess)试剂0. 5gA液：对氨基苯磺酸10%稀醋酸150mlB液：a-萘胺0.1g蒸馏水20ml150ml10%稀醋酸十、二苯胺试剂二苯胺0.5g溶于100ml浓硫酸中，用20ml蒸馏水稀释。十一、阿氏(Alsever）血液保存液8g柠檬酸三钠·2H0柠檬酸0. 5g无水葡萄糖18.7gNaC14.2g蒸馏水1000ml将各成分溶解于蒸馏水后，用滤纸过滤，分装，115℃灭菌20min。冰箱保存备用。十二、肝素溶液用生理盐水将肝素分别稀释成25单位/毫升和200单位/毫升，配好后，115℃10min高压灭菌，置4℃下备用。大约12.5单位肝素可抗凝1ml全血。十三、pH8.5离子强度0.075mo1/L巴比妥缓冲液156
156 七、V.P．试剂 1．5%α-萘酚无水乙醇溶液 α-萘酚 5g 无水乙醇 100ml 2．40%KOH 溶液 KOH 40g 蒸馏水 100ml 八、吲哚试剂 对二甲基氨基苯甲醛 2g 95%乙醇 190ml 浓盐酸 40ml 九、格里斯氏(Griess)试剂 A 液：对氨基苯磺酸 0.5g 10%稀醋酸 150ml B 液：α-萘胺 0.1g 蒸馏水 20ml 10%稀醋酸 150ml 十、二苯胺试剂 二苯胺 0.5g 溶于 100ml 浓硫酸中，用 20ml 蒸馏水稀释。 十一、阿氏(Alsever)血液保存液 柠檬酸三钠·2H2O 8g 柠檬酸 0.5g 无水葡萄糖 18.7g NaCl 4.2g 蒸馏水 1000ml 将各成分溶解于蒸馏水后，用滤纸过滤，分装，115℃灭菌 20min。冰箱保存备用。 十二、肝素溶液 用生理盐水将肝素分别稀释成 25 单位/毫升和 200 单位/毫升，配好后，115℃10min 高压灭 菌，置 4℃下备用。大约 12.5 单位肝素可抗凝 1ml 全血。 十三、pH 8.5 离子强度 0.075mol/L 巴比妥缓冲液
巴比妥2. 76g巴比妥钠15. 45g蒸馏水1000ml十四、1%离子琼脂琼脂粉1g巴比妥缓冲液50ml蒸馏水50ml1滴1%硫柳汞称取琼脂粉1g先加至50ml蒸馏水中，于沸水浴中加热溶解，然后加入50ml巴比妥缓冲液，再滴加1滴1%硫柳汞溶液防腐，分装试管内，放冰箱中备用。十五、质粒制备、转化和染色体DNA提取的溶液配制1.溶液I葡萄糖50mol/L25 mol/LTris-HC1 (pH8. 0)EDTA10mol/L溶液可配制成100ml，121℃灭菌15min，4℃贮存。2.溶液ⅡI（新鲜配制）NaOH0.2 mo1/LSDS0. 1%3.溶液IⅢI（100ml，pH4.8)60ml5mol/LKAc冰醋酸11.5ml水28.5ml配置好的溶液IⅢI含3mol/L钾盐，5mo1/L醋酸4.溶液IV酚：氯仿：异戊醇=25:24:15.TE缓冲液Tris-HC1 (pH8. 0)10mmol/L1m mol/LEDTA (pH8. 0)121℃灭菌15min，4℃贮存。6.TAE电泳缓冲液（50倍浓贮存液100ml）157
157 巴比妥 2.76g 巴比妥钠 15.45g 蒸馏水 1000ml 十四、1%离子琼脂 琼脂粉 1g 巴比妥缓冲液 50ml 蒸馏水 50ml 1%硫柳汞 1 滴 称取琼脂粉 1g 先加至 50ml 蒸馏水中，于沸水浴中加热溶解，然后加入 50ml 巴比妥缓冲液， 再滴加 1 滴 1%硫柳汞溶液防腐，分装试管内，放冰箱中备用。 十五、质粒制备、转化和染色体 DNA 提取的溶液配制 1. 溶液Ⅰ 葡萄糖 50mol/L Tris-HCl(pH8.0) 25 mol/L EDTA 10 mol/L 溶液可配制成 100ml，121℃灭菌 15min，4℃贮存。 2. 溶液Ⅱ（新鲜配制） NaOH 0.2 mol/L SDS 0.1% 3. 溶液Ⅲ（100ml，pH4.8） 5 mol/L KAc 60ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml 配置好的溶液Ⅲ含 3 mol/L 钾盐，5 mol/L 醋酸 4. 溶液Ⅳ 酚:氯仿:异戊醇=25:24:1 5. TE 缓冲液 Tris-HCl(pH8.0) 10m mol/L EDTA(pH8.0) 1m mol/L 121℃灭菌 15min，4℃贮存。 6. TAE 电泳缓冲液（50 倍浓贮存液 100ml）
Tris碱242g57. 1ml冰醋酸100ml0.5mo1/LEDTA(pH8.0)使用时用双蒸馏水稀释50倍。7.凝胶加样缓冲液100ml溴酚蓝0.25g燕糖40g8.1mg/ml溴化乙锭（ethidiumbromide，简称EB）溴化乙锭100mg双蒸水100ml溴化乙锭是强诱变剂，配制时要戴手套，一般由教师配制好，盛于棕色试剂瓶中，避光贮存4℃9.5mol/LNaCl在800ml水中溶解292.2gNaC1加水定容到1L，分装后高压灭菌。10.CTAB/NaC1溶解4.1gNaCl于80Oml水中，缓慢加CTAB（hexadecyltrimethylammoniumbromide），边加热边搅拌，如果需要，可加热到65℃使其溶解，调最终体积到100ml。11.蛋白酶K（20mg/ml）将蛋白酶K溶于无菌双蒸水或5mmo1/LEDTA,0.5%SDS缓冲液中。12.1mo1/LCaCl2在200ml双蒸水中溶解54gCaC12·6H20用0.22μm滤膜过滤器除菌，分装成10ml小份贮存于-20℃制备感受态时，取出一小份解冻，并用双蒸水稀释至100ml，用0.45μm的滤膜除菌，然后骤冷0℃。十六、Hanks液以下化学药品要求化学纯1.母液甲ONaC1160gKC14g2gMgC12·6H20158
158 Tris 碱 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/LEDTA(pH8.0) 100ml 使用时用双蒸馏水稀释 50 倍。 7. 凝胶加样缓冲液 100ml 溴酚蓝 0.25g 蔗糖 40g 8. 1mg/ml 溴化乙锭（ethidium bromide,简称 EB） 溴化乙锭 100mg 双蒸水 100ml 溴化乙锭是强诱变剂，配制时要戴手套，一般由教师配制好，盛于棕色试剂瓶中，避光贮存 4℃。 9. 5mol/LNaCl 在 800ml 水中溶解 292.2gNaCl 加水定容到 1L,分装后高压灭菌。 10. CTAB/NaCl 溶解 4.1gNaCl 于 80ml 水中，缓慢加 CTAB(hexadecyltrimethyl ammonium bromide),边加热边 搅拌，如果需要，可加热到 65℃使其溶解，调最终体积到 100ml。 11. 蛋白酶 K（20mg/ml） 将蛋白酶 K 溶于无菌双蒸水或 5m mol/L EDTA,0.5% SDS 缓冲液中。 12. 1mol/LCaCl2 在 200ml 双蒸水中溶解 54g CaCl2·6H2O,用 0.22μm 滤膜过滤器除菌，分装成 10ml 小份， 贮存于-20℃. 制备感受态时，取出一小份解冻，并用双蒸水稀释至 100ml,用 0.45μm 的滤膜除菌，然后 骤冷 0℃。 十六、Hanks 液 以下化学药品要求化学纯 1. 母液甲 ①NaCl 160g KCl 4g MgCl2·6H2O 2g
2gMgS0,·7H20加蒸馅水800mlCaCl?2. 8g溶于100ml双蒸水中。与②混合，加蒸馏水至1000ml，加氯仿2ml，4℃保存。2.母液乙NazHPO.·12H203. 04gKH,PO,1. 2g葡萄糖20g100ml0.4%酚红溶液加双蒸馏水至1000ml，加氯仿2ml，4℃下保存，或115℃10min高压灭菌后保存。3.使用液取甲、乙母液各100ml混合，加双蒸水1800ml，分装小瓶，115℃10min灭菌，保存于4℃下备用。十七、其他细胞悬液的配制1.1%鸡红细胞悬液取鸡翼下静脉血或心脏血，注入含灭菌阿氏液的玻璃瓶内，使血与阿氏液的比例为1：5，放冰箱中保存2~4周。临用前取出适量鸡血，用无菌生理盐水洗涤，离心，倾去生理盐水，如此反复洗涤三次，最后一次离心使成积压红细胞，然后用生理盐水配成1%。供吞噬试验用。2.白色葡萄球菌菌液白色葡萄球菌接种于肉汤培养基中，37℃温箱培养12h左右，置水浴中加热100℃，10min杀死细菌，用无菌生理盐水配制成每毫升含6亿个细胞，分装于小瓶内，置冰箱保存备用。159
159 MgSO4·7H2O 2g 加蒸馏水 800ml ②CaCl2 2.8g 溶于 100ml 双蒸水中。 ①与②混合，加蒸馏水至 1000ml，加氯仿 2ml,4℃保存。 2. 母液乙 Na2HPO4·12H2O 3.04g KH2PO4 1.2g 葡萄糖 20g 0.4%酚红溶液 100ml 加双蒸馏水至 1000ml，加氯仿 2ml，4℃下保存，或 115℃10min 高压灭菌后保存。 3. 使用液 取甲、乙母液各 100ml 混合，加双蒸水 1800ml，分装小瓶，115℃10min 灭菌，保存于 4℃ 下备用。 十七、其他细胞悬液的配制 1．1%鸡红细胞悬液 取鸡翼下静脉血或心脏血，注入含灭菌阿氏液的玻璃瓶内，使血与阿氏液的比例为 1:5，放 冰箱中保存 2~4 周。临用前取出适量鸡血，用无菌生理盐水洗涤，离心，倾去生理盐水，如此反 复洗涤三次，最后一次离心使成积压红细胞，然后用生理盐水配成 1%。供吞噬试验用。 2．白色葡萄球菌菌液 白色葡萄球菌接种于肉汤培养基中，37℃温箱培养 12h 左右，置水浴中加热 100℃，10min 杀死细菌，用无菌生理盐水配制成每毫升含 6 亿个细胞，分装于小瓶内，置冰箱保存备用