（10）电子天平（11）分光光度计2.试剂（1）1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取100mg分析纯葡萄糖（预先在80℃烘至恒重2，置于小烧杯中，用少量蒸罐水溶解后，定量转移到100m的容最瓶中，以蒸馅水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。（2）3，5-二硝基水杨酸试剂：将6.3g3，5-二硝基水杨酸和262ml2mol/LNaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。（3）碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100ml蒸馏水中。（4）酚酥指示剂：称取0.1g酚，溶于250ml70%乙醇中。(5）6mol/LHCl。(6)6mol/LNaOH。3.材料食用面粉。四、操作步骤1.制作葡萄糖标准曲线取7支25ml刻度试管，编号，按下表操作。012管号345600.20.40.60.81.01.2葡萄糖标准液（ml）蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.00.81.51.51.51.51.51.51.53，5-二硝基水杨酸（ml）将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定容至25ml，混匀。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取1～6号管的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。2.样品中还原糖和总糖含量的测定（1）样品中还原糖的提取：准确称取3g食用面粉，放在100ml三角瓶中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加50ml蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。离心或过滤，用20ml蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的上清液或滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馅水定容至刻度，混匀，作为还原18
18 （10）电子天平 （11）分光光度计 2．试剂 （1）1mg/ml 葡萄糖标准液：准确称取 100mg 分析纯葡萄糖（预先在 80℃烘至 恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到 100ml 的容最瓶中，以蒸 馏水定容至刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 （2）3，5-二硝基水杨酸试剂：将 6.3g3，5-二硝基水杨酸和 262ml2mol/LNaOH 溶液，加到 500ml 含有 185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加 5g 结晶酚和 5g 亚硫酸 钠，搅拌溶解。冷却后加蒸馏水定容至 1000ml，贮于棕色瓶中备用。 （3）碘-碘化钾溶液：称取 5g 碘和 10g 碘化钾，溶于 100ml 蒸馏水中。 （4）酚酞指示剂：称取 0.1g 酚酞，溶于 250ml70％乙醇中。 （5）6mol／LHCl。 （6）6mol／LNaOH。 3．材料 食用面粉。 四、操作步骤 1．制作葡萄糖标准曲线 取 7 支 25ml 刻度试管，编号，按下表操作。 管号 0 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 3，5-二硝基水杨酸（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 将各管摇匀，在沸水浴中加热 5min，取出后立即冷却至室温，再以蒸馏水定容 至 25ml，混匀。在 540nm 波长下，用 0 号管调零，分别读取 l～6 号管的吸光度。以 吸光度为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。 2．样品中还原糖和总糖含量的测定 （1）样品中还原糖的提取：准确称取 3g 食用面粉，放在 100ml 三角瓶中，先以 少量蒸馏水调成糊状，然后加 50ml 蒸馏水，搅匀，置于 50℃恒温水浴中保温 20min， 使还原糖浸出。离心或过滤，用 20ml 蒸馏水洗残渣，再离心或过滤，将两次离心的 上清液或滤液全部收集在 100ml 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原
糖待测液。（2）样品中总糖的水解和提取：准确称取1g食用面粉，放在100ml的三角瓶中，加入10ml6mol/LHCl及15ml蒸馏水，置于沸水浴中加热水解30min。取1～2滴水解液于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾溶液，检查水解是否完全。如已水解完全，则不显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚指示剂，以6mol/LNaOH中和至微红色，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤液全部收集在100ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。精确吸取10ml定容过的水解液，移入另一100ml的容量瓶中，以水稀释定容，混匀，作为总糖待测液。（3）显色和比色，取4支25ml刻度试管，编号，按下表所示的量操作。总糖测定管号还原糖测定管号管号①②1II2200还原糖待测液（ml)0011总糖待测液（ml）1010蒸馏水（ml）1.51.51.51.53，5-二硝基水杨酸（ml）其余操作均与制作葡萄糖标准曲线时相同。五、结果处理以管①、②的吸光度值和管I、Ⅱ的吸光度值，分别在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数。按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。提取液总体积查曲线所得还原糖质量（mg）测定时取用体积×100还原糖%=样品质量（mg）查曲线所得水解后还原糖质量（mg)×稀释倍数×100总糖%=样品质量（mg）六、注意事项标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。七、思考题1.可用不同材料，以比较含糖量的差异。2.面粉中主要含有何种糖？3.在提取糖时，其他杂质是否会影响到测定？19
19 糖待测液。 （2）样品中总糖的水解和提取：准确称取 1g 食用面粉，放在 100ml 的三角瓶中， 加入 10ml6mol／LHCl 及 15ml 蒸馏水，置于沸水浴中加热水解 30min。取 1～2 滴水 解液于白瓷板上，加 1 滴碘-碘化钾溶液，检查水解是否完全。如已水解完全，则不 显蓝色。待三角瓶中的水解液冷却后，加入 1 滴酚酞指示剂，以 6mol／LNaOH 中和 至微红色，过滤，再用少量蒸馏水冲洗三角瓶及滤纸，将滤液全部收集在 100ml 的容 量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。精确吸取 10ml 定容过的水解液，移入另一 100ml 的容量瓶中，以水稀释定容，混匀，作为总糖待测液。 （3）显色和比色，取 4 支 25ml 刻度试管，编号，按下表所示的量操作。 管号 还原糖测定管号 总糖测定管号 ① ② Ⅰ Ⅱ 还原糖待测液（ml） 2 2 0 0 总糖待测液（ml） 0 0 1 1 蒸馏水（ml） 0 0 1 1 3，5-二硝基水杨酸（ml） 1.5 1.5 1.5 1.5 其余操作均与制作葡萄糖标准曲线时相同。 五、结果处理 以管①、②的吸光度值和管 I、Ⅱ的吸光度值，分别在标准曲线上查出相应的还 原糖毫克数。按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。 % ×100 × = 样品质量（ ） 测定时取用体积 提取液总体积 查曲线所得还原糖质量（ ） 还原糖 mg mg % ×100 × = 样品质量（ ） 查曲线所得水解后还原糖质量（ ） 稀释倍数 总糖 mg mg 六、注意事项 标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。 七、思考题 1．可用不同材料，以比较含糖量的差异。 2．面粉中主要含有何种糖？ 3．在提取糖时，其他杂质是否会影响到测定？
实验五过氧化氢活性的测定一一碘量法一、原理过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小以一定时间内分解的过氧化氢量来表示。当酶与底物（过氧化氢)反应结束后，再用碘量法测未分解的过氧化氢量。以钼酸铵作催化剂，使过氧化氢与碘化钾反应，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定碘，其反应为：H202+2KI+H,S04组酸钱>12+K,S04+2H20I2+2Na2S,O→2Nal+Na2S406根据空白样和测定样两者滴定值之差，即可求出酶分解的过氧化氢量。二、实验材料、仪器和试剂1.实验材料白菜、水稻或其他植物新鲜叶片2.仪器（1）天平（2）研钵（3）容量瓶100ml2个（4）酸式滴定管50mll支（5）恒温水浴锅（6）移液管10mll支，5ml2支，1mll支（7）三角瓶100ml4个3.试剂（1）碳酸钙粉末（2）1.8mol/L硫酸：取100ml烧杯1只，加入约500ml蒸馏水，边搅拌边沿壁缓慢加入100ml浓硫酸，冷却后用容量瓶定容至1000ml。（3）10%钼酸铵溶液：称取钼酸铵10g，溶于蒸馅水中，稀释至100ml。（4）1%淀粉溶液：取1g可溶性淀粉于小烧杯中，加入约20ml水调匀，然后慢慢倾入约80ml沸水中，在搅拌条件下加热至重新沸腾，冷却后贮于滴瓶中（可加少量的Hgl2防腐。（5）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液：称取Na2S2O3-5H2025g，溶于新煮沸并冷却的蒸馏水中，加入约0.1gNa2CO3并稀释至1L，保存于棕色试剂瓶中，放置暗处，1天后进行标定。20
20 实验五 过氧化氢酶活性的测定——碘量法 一、原理 过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小以一定时间内分解的过氧化 氢量来表示。当酶与底物(过氧化氢)反应结束后，再用碘量法测未分解的过氧化氢量。 以钼酸铵作催化剂，使过氧化氢与碘化钾反应，放出游离碘，然后用硫代硫酸钠滴定 碘，其反应为： H 2O2 + 2KI + H 2 SO4 → I 2 + K2 SO4 + 2H 2O 钼酸铵 2 2Na2 S2O3 2NaI Na2 S4O6 I + → + 根据空白样和测定样两者滴定值之差，即可求出酶分解的过氧化氢量。 二、实验材料、仪器和试剂 1．实验材料 白菜、水稻或其他植物新鲜叶片 2．仪器 （1）天平 （2）研钵 （3）容量瓶 100ml2 个 （4）酸式滴定管 50mll 支 （5）恒温水浴锅 （6）移液管 10mll 支，5ml2 支，1ml1 支 （7）三角瓶 100ml4 个 3．试剂 （1）碳酸钙粉末 （2）1.8mol/L 硫酸：取 100ml 烧杯 1 只，加入约 500ml 蒸馏水，边搅拌边沿壁 缓慢加入 100ml 浓硫酸，冷却后用容量瓶定容至 1000ml。 （3）10％钼酸铵溶液：称取钼酸铵 10g，溶于蒸馏水中，稀释至 100ml。 （4）1％淀粉溶液：取 1g 可溶性淀粉于小烧杯中，加入约 20ml 水调匀，然后慢 慢倾入约 80ml 沸水中，在搅拌条件下加热至重新沸腾，冷却后贮于滴瓶中（可加少 量的 HgI2 防腐）。 （5）0.1 mol/L 硫代硫酸钠溶液：称取 Na2S2O3·5H2O 25g，溶于新煮沸并冷却的 蒸馏水中，加入约 0.1g Na2CO3 并稀释至 1 L，保存于棕色试剂瓶中，放置暗处，1 天 后进行标定
标定方法：精确称取分析纯K2Cr2Oz0.15g于500ml三角瓶中，加30ml蒸馏水溶解。加入2gKl和5ml6mol/L盐酸，在暗处放置5min，然后用水稀释至200ml，用0.1mol/L硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液由棕红色变为浅黄色时，加入1ml淀粉溶液，继续滴至溶液由蓝色变成亮绿色（Cr3+离子的颜色）为止。计算出NazS2O的物质的量浓度。（6）0.02mol/L硫代硫酸钠溶液：用20ml移液管吸取已标定的0.1mol/L硫代硫酸钠溶液20ml，加入100ml容量瓶中，加水定容，摇匀即成，用时现配。（7）0.05mol/L过氧化氢溶液：取1ml30%的过氧化氢溶液用水稀释至150ml，用0.05mol/L硫代硫酸钠溶液标定。（8）20%碘化钾溶液。三、操作步骤1.酶液的提取：称取混匀的新鲜白菜叶柄5g置研钵中，加0.2g碳酸钙和蒸馏水2ml，仔细研磨成匀浆，移入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，振荡片刻，静置。取上清液10ml移入100ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。0.02mol/L0.05mol/L1.8mol/L1.8mol/L20%KI钼酸淀粉管酶Na,S,O,溶溶液铵溶溶液HsO浴H02溶液保温H,SO溶号液液滴定量液(ml)液(滴)(滴)(ml)液(ml)(ml)(ml)555513120℃5513525下555--3535min553545-2.酶液的测定：取4个100ml三角瓶编号，按上表操作。用0.01mol/L硫代硫酸钠铬液滴定至蓝色消失。四、结果计算用空白滴定值减去样品滴定值即可求出此期间酶所分解的过氧化氢量。被分解的H,O,量(mg）=[空白滴定值(ml)一样品滴定值(ml))x硫代硫酸钠物质的量浓度×34.0221
21 标定方法：精确称取分析纯 K2Cr2O7 0.15g 于 500ml 三角瓶中，加 30ml 蒸馏水溶 解。加入 2g KI 和 5ml 6mol/L 盐酸，在暗处放置 5min，然后用水稀释至 200ml，用 0.1mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液由棕红色变为浅黄色时，加入 1ml 淀粉溶液， 继续滴至溶液由蓝色变成亮绿色（Cr3+离子的颜色）为止。计算出 Na2S2O3 的物质的 量浓度。 （6）0.02 mol/L 硫代硫酸钠溶液：用 20ml 移液管吸取已标定的 0.1mol/L 硫代硫 酸钠溶液 20ml，加入 100ml 容量瓶中，加水定容，摇匀即成，用时现配。 （7）0.05mol/L 过氧化氢溶液：取 1ml 30％的过氧化氢溶液用水稀释至 150ml， 用 0.05mol/L 硫代硫酸钠溶液标定。 （8）20％碘化钾溶液。 三、操作步骤 1. 酶液的提取：称取混匀的新鲜白菜叶柄 5g 置研钵中，加 0.2g 碳酸钙和蒸馏水 2ml，仔细研磨成匀浆，移入 100ml 容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，振荡片刻，静 置。取上清液 10ml 移入 100ml 容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。 管 号 酶 液 1.8mol/L H2SO4溶 液(ml) 0.05mol/L H2O2溶液 (ml) 保温 1.8mol/L H2SO4溶 液(ml) 20%KI 溶液 (ml) 钼酸 铵溶 液(滴) 淀粉 溶液 (滴) 0.02mol/L Na2S2O3溶 液滴定量 (ml) 1 5 － 5 20℃ 下 5min 5 1 3 5 2 5 － 5 5 1 3 5 3 5 5 5 － 1 3 5 4 5 5 5 － 1 3 5 2. 酶液的测定：取 4 个 100ml 三角瓶编号，按上表操作。 用 0.01mol/L 硫代硫酸钠镕液滴定至蓝色消失。 四、结果计算 用空白滴定值减去样品滴定值即可求出此期间酶所分解的过氧化氢量。 被分解的 H2O2 量(mg）＝[空白滴定值(ml)—样品滴定值(ml)]×硫代硫酸钠物质的 量浓度×34.02
被分解的H,0,量（mg)×酶液总体积（ml）测定时用酶液量（ml）过氧化氢酶活性=-样品质量（g）x时间（min）式中：34.02为过氧化氢摩尔质量。附：过氧化氢含量测定及过氧化氢酶活性测定一一高锰酸钾滴定法和紫外吸收法植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除HO2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。一、过氧化氢含量的测定【原理】H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物一钛复合物黄色沉淀，可被H2SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与HOz浓度呈线性关系。【仪器和用具】研钵；移液管0.2mlx×2支，5mlx1支；容量瓶10ml×7个，离心管5mlx8支；离心机；分光光度计。【试剂】100umol/LH,O2丙酮试剂：取30%分析纯H,02（市售30%Hz02大约等于17.6mol/L）57ul，溶于100ml丙酮中，再用丙酮稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮：浓氨水。【方法】1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表1加入试剂。22
22 样品质量（ ） 时间（ ） 酶液总体积（ ） 测定时用酶液量（ ） 被分解的 量（ ） 过氧化氢酶活性 min 2 2 × × = g ml ml H O mg 式中：34.02 为过氧化氢摩尔质量。 附： 过氧化氢含量测定及过氧化氢酶活性测定 －－高锰酸钾滴定法和紫外吸收法 植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使 H2O2 发生累积。H2O2可 以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而 加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除 H2O2，是植物体内重要的酶促防御系 统之一。因此，植物组织中 H2O2 含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。 本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧 化氢酶活性。 一、过氧化氢含量的测定 【原理】 H2O2 与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被 H2SO4 溶 解后，在 415nm 波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与 H2O2浓度呈线性关 系。 【仪器和用具】 研钵；移液管 0.2ml×2 支，5ml×1 支；容量瓶 10ml×7 个，离心管 5ml×8 支；离 心机；分光光度计。 【试剂】 100µmol/L H2O2 丙酮试剂：取 30%分析纯 H2O2 (市售 30% H2O2 大约等于 17.6mol/L) 57µl，溶于 100ml 丙酮中，再用丙酮稀释 100 倍；2mol/L 硫酸；5%（W/V） 硫酸钛；丙酮；浓氨水。 【方法】 1. 制作标准曲线：取 10ml 离心管 7 支，顺序编号，并按表 1 加入试剂