表1测定H,O,浓度标准曲线配置表离心管号试剂（ml)123456700.10.20.40.60.81.0100μumol/LH,01.00.90.80.40.20.604℃下预冷丙酮0.10.10.10.10.10.15%硫酸钛0.10.20.20.2浓氨水0.20.20.20.23000r/min离心10min，弃去上清夜，留沉淀5.05.05.05.05.02mol/L硫酸5.05.0待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馅水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。2.样品提取和测定：（1)称取新鲜植物组织2~5g（视HOz含量多少而定），按材料与提取剂1：1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液，将其定容至一定体积。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3~5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。3.结果计算：CxV,植物组织中H,,含量（umol/gFW）=FW×V,式中C一标准曲线上查得1ml样品提取液中H2O2的量（umol）V一样品提取液总体积（ml）;Vi一测定时用样品提取液体积（ml）;FW一植物组织鲜重（g）。二、过氧化氢酶的活性测定一高锰酸钾滴定法【原理】过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。2e-R(Fe+2)+H2O2=-R(Fe+3+OH)2eR(Fe*30H~)2+H202==R(Fe+)2+2H2O+0223
23 表 1 测定 H2O2浓度标准曲线配置表 试剂（ml） 离 心 管 号 1 2 3 4 5 6 7 100μmol/L H2O2 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 4℃下预冷丙酮 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 5%硫酸钛 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 浓氨水 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 3000r/min 离心 10min，弃去上清夜，留沉淀 2mol/L 硫酸 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 待沉淀完全溶解后，将其小心转入 10ml 容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离 心管，将洗涤液合并后定容至 10ml 刻度，415nm 波长下比色。 2. 样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织 2~5g（视 H2O2含量多少而定），按材 料与提取剂 1∶1 的比例加入 4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心 管 3000 r/min 下离心 10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液，将其定容至一定体 积。(2)用移液管吸取样品提取液 1ml，按表 35-1 加入 5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形 成后 3000rpm/min 离心 10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤 3～5 次，直到去 除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入 2mol 硫酸 5ml，待完全溶解后，与标准曲线 同样的方法定容并比色。 3. 结果计算： 1 2 2 / FW V C V H O mol gFW t × × 植物组织中 含量（µ ）= 式中 C—标准曲线上查得 1ml 样品提取液中 H2O2的量（μmol）； Vt—样品提取液总体积（ml）； V1—测定时用样品提取液体积（ml）； FW—植物组织鲜重（g）。 二、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法 【原理】 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分 子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－) R(Fe+3OH－)2+H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2 2e－ 2e－
据此，可根据H,O的消耗量或O的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的HO，溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O25H2O+2KMnO4+4H2SO4>5O2+2KHSO4+8H20+2MnS04即可求出消耗的H2O2的量。【仪器和用具】研钵；三角瓶50mlx4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。【试剂】10%H2SO4;0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8;0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馅水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/LH202:市售30%H202大约等于17.6mol/L，取30%H20z溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C204-2H2012.607g，用蒸馅水溶解后，定容至1L【方法】1.酶液提取取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml0.1mol/LH2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。3.用0.1mol/LKMnO4标准溶液滴定H,O2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。4.结果计算：酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：酶活(mgH20,/gFW·min)=(4-B)×V,×8.5FW×V,×t式中A一对照组KMnO4滴定毫升数的平均值；B一测定组酶反应后KMnO4滴定毫升数的平均值；Vr一酶液总量（ml);Vi一反应所用酶液量（ml）W一样品鲜重（g）;t-反应时间（min）8.5—1ml0.1mol/L的KMnO4相当于8.5mgH2O2。24
24 据此，可根据 H2O2的消耗量或 O2 的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加 入一定量（反应过量）的 H2O2 溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性 条件下）滴定多余的 H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 即可求出消耗的 H2O2 的量。 【仪器和用具】 研钵；三角瓶 50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶 25ml×1。 【试剂】 10% H2SO4； 0.2mol/L 磷酸缓冲液 pH7.8； 0.1mol/L 高锰酸钾标准液：称取 KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配 制成 1000ml，用 0.1mol/L 草酸溶液标定； 0.1mol/L H2O2：市售 30% H2O2 大约等于 17.6mol/L，取 30% H2O2 溶液 5.68ml， 稀释至 1000ml，用标准 0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定； 0.1mol/L 草酸：称取优级纯 H2C2O4 ·2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至 1L。 【方法】 1. 酶液提取 取小麦叶片 2.5g 加入 pH7.8 的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆， 转移至 25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓 冲液定容，4000rpm 离心 15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 2. 取 50ml 三角瓶 4 个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液 2.5ml，对照瓶 中加入煮死酶液 2.5ml，再加入 2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于 30℃恒温水浴中 保温 10min，立即加入 10% H2SO4 2.5ml。 3. 用 0.1mol/L KMnＯ4标准溶液滴定 H2O2，至出现粉红色（在 30min 内不消失） 为终点。 4.结果计算： 酶活性用每克鲜重样品 1min 内分解 H2O2的毫克数表示： FW V t A B V mgH O gFW T × × − × × ⋅ = 1 2 2 8.5 / min （ ） 酶活（ ） 式中 A—对照组 KMnO4滴定毫升数的平均值； B—测定组酶反应后 KMnO4 滴定毫升数的平均值； VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）; W—样品鲜重（g）； t－反应时间（min） 8.5—1ml 0.1mol/L 的 KMnO4相当于 8.5mg H2O2
【注意】所用KMnO4溶液及H,O,溶液临用前要经过重新标定。三、过氧化氢酶的活性测定一紫外吸收法【原理】H,O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与用具】紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；【试剂】0.2mol/LpH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）;0.1mol/LH2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。【方法】1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2~3ml4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2顺序加入试剂。表2紫外吸收法测定H2O样品液配置表管号SI（样品）S2（样品）SO（对照）0.2粗酶液(ml)0.20.21.51.51.5pH7.8磷酸(ml)1.01.01.0蒸馅水(ml)25℃预热后，逐管加入0.3ml0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。3.结果计算：以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。A240×VT过氧化氢酶活性（μlgFW/min）=0.1xV,×t×FW25
25 【注意】 所用 KMnO4溶液及 H2O2溶液临用前要经过重新标定。 三、过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法 【原理】 H2O2 在 240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸 光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活 性。 【仪器与用具】 紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml 容量瓶 1 个；0.5ml 刻度吸管 2 支，2ml 刻度吸管 1 支；10ml 试管 3 支；恒温水浴； 【试剂】 0.2mol/L pH7.8 磷酸缓冲液（内含 1%聚乙烯吡咯烷酮）； 0.1mol/L H2O2（用 0.1mol/L 高锰酸钾标定）。 【方法】 1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织 0.5g 置研钵中，加入 2～3ml 4℃ 下预冷的 pH7.0 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入 25ml 容量瓶中，并用 缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置 5℃冰箱中静 置 10min，取上部澄清液在 4000rpm 下离心 15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃ 下保存备用。 2. 测定：取 10ml 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管，1 支为空白管，按表 2 顺 序加入试剂。 表 2 紫外吸收法测定 H2O2样品液配置表 管 号 S1（样品） S2（样品） S0（对照） 粗酶液(ml) 0.2 0.2 0.2 pH7.8 磷酸(ml) 1.5 1.5 1.5 蒸馏水(ml) 1.0 1.0 1.0 25℃预热后,逐管加入 0.3ml 0.1mol/L 的 H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入 石英比色杯中，240nm 下测定吸光度，每隔 1min 读数 1 次，共测 4min，待 3 支管全 部测定完后，按下式计算酶活性。 3.结果计算： 以 1min 内 A240减少 0.1 的酶量为 1 个酶活单位（u）。 V t FW A V gFW T × × × ∆ × = 1 240 0.1 过氧化氢酶活性（µ / / min）
(Asi + As2)式中A240=Aso-2Aso一加入煮死酶液的对照管吸光值；As1,As2一样品管吸光值；Vt一粗酶提取液总体积（ml);Vi一测定用粗酶液体积（ml);FW一样品鲜重（g）;0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）;t一加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。【注意事项】凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。26
26 2 1 2 240 0 （ ） 式中 S S S A A A A + ∆ = − AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2—样品管吸光值； Vt—粗酶提取液总体积（ml）； V1—测定用粗酶液体积（ml）； FW—样品鲜重（g）； 0.1—A240每下降 0.1 为 1 个酶活单位（u）； t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 【注意事项】 凡在 240nm 下有强吸收的物质对本实验有干扰
实验六维生素C的定量测定一、原理维生素C又称抗坏血酸，在绿色植物和水果中含量尤为丰富。在酸性溶液中，氧化型染料2，6-二氯酚靛酚呈红色，能被维生素C还原为无色，而维生素C则从还原型转变为氧化型。即还原型维生素C十2，6-二氯酚靛酚（红色）→氧化型维生素C十还原型2，6-二氯酚靛酚（无色）当用氧化型染料溶液（蓝色）滴定含有维生素C的酸性溶液时，在维生素C尚未全部被氧化前，滴下的2，6-二氯酚靛酚被还原呈无色：当维生素C全部被氧化时，则滴下的2，6-二氯酚靛酚立即使酸性溶液呈现红色。根据滴定中所消耗的染料量，可计算样品中维生素C的含量。本法简便易行，但有一些缺点。一方面，在生物体内维生素C有还原型、氧化型以及结合态的形式存在，这三种形式同样具有生理功能，但后两者不能将2，6-二氯酚靛酚还原脱色。此外，生物组织提取液中常有色素存在，给滴定终点的观察带来困难。二、实验材料、仪器和试剂1.实验材料桔皮、绿叶蔬菜或松针等。2.仪器（1）天平（2）研钵（3）容量瓶（50ml）（4）微量滴定管（5ml）（5）锥形瓶（50ml）（6）移液管（5ml，10ml）（8）剪刀（7）量筒（100ml）（9）玻璃漏斗（10）滤纸3.试剂（1）1%盐酸溶液吸取5ml浓盐酸（36一38%）溶于180ml蒸馏水中。（2）1%草酸溶液称取5g草酸，用蒸馏水溶解，稀释到500ml。（3）标准抗坏血酸溶液（0.2mg/mL）准确称取维生素C40mg溶于1%草酸溶液中，转移至200mL容量瓶中定容至刻度。贮存于棕色瓶内，临用前配制。（4）2，6-二氯酚靛酚溶液将200mL蒸馏水加热煮沸，先将52mg碳酸氢钠27
27 实验六 维生素 C 的定量测定 一、原理 维生素 C 又称抗坏血酸，在绿色植物和水果中含量尤为丰富。在酸性溶液中，氧 化型染料 2，6-二氯酚靛酚呈红色，能被维生素 C 还原为无色，而维生素 C 则从还原 型转变为氧化型。即 还原型维生素 C＋2，6-二氯酚靛酚（红色）→氧化型维生素 C＋还原型 2，6-二 氯酚靛酚（无色） 当用氧化型染料溶液（蓝色）滴定含有维生素 C 的酸性溶液时，在维生素 C 尚 未全部被氧化前，滴下的 2，6-二氯酚靛酚被还原呈无色；当维生素 C 全部被氧化时， 则滴下的 2，6-二氯酚靛酚立即使酸性溶液呈现红色。根据滴定中所消耗的染料量， 可计算样品中维生素 C 的含量。 本法简便易行，但有一些缺点。一方面，在生物体内维生素 C 有还原型、氧化型 以及结合态的形式存在，这三种形式同样具有生理功能，但后两者不能将 2，6-二氯 酚靛酚还原脱色。此外，生物组织提取液中常有色素存在，给滴定终点的观察带来困 难。 二、实验材料、仪器和试剂 1．实验材料 桔皮、绿叶蔬菜或松针等。 2．仪器 （1）天平 （2）研钵 （3）容量瓶（50ml） （4）微量滴定管（5ml） （5）锥形瓶（50ml） （6）移液管（5ml，10ml） （7）量筒（100ml） （8）剪刀 （9）玻璃漏斗 （10）滤纸 3．试剂 （1） 1％盐酸溶液 吸取 5ml 浓盐酸（36－38％）溶于 180ml 蒸馏水中。 （2） 1％草酸溶液 称取 5g 草酸，用蒸馏水溶解，稀释到 500ml。 （3） 标准抗坏血酸溶液（0.2mg/mL） 准确称取维生素 C 40mg 溶于 1％草酸 溶液中，转移至 200mL 容量瓶中定容至刻度。贮存于棕色瓶内，临用前配制。 （4） 2，6-二氯酚靛酚溶液 将 200mL 蒸馏水加热煮沸，先将 52mg 碳酸氢钠