处划一条平行于底边的很轻的直线做为基线。沿直线以一定的间隔做标记以指示标准氨基酸和蛋白质水解液的加样位置。用毛细管吸少量氨基酸样品点于标记的位置上。点样时，毛细管口应与滤纸轻轻接触，样点直径一般控制在0.3cm之内。用吹风机稍加吹干后再点下一次，重复3次，每次的样品点应完全重合。加样完毕后，将滤纸卷成圆筒状，使基线吻合，两边不搭接，用针和线将纸两边缝合。将点好样品的滤纸移入层析缸中（层析缸内事先加入一个注入40ml展层剂的直径为10cm的培养皿，使液层厚度为1cm左右，盖上层析缸的盖子20min，以保证罩内有一定蒸汽压），采用上行法进行展层。当溶剂前沿上升到距纸上端1cm时，取出滤纸，立即用铅笔记下溶剂前沿的位置，剪断缝线，用吹风机吹干滤纸上的溶剂。之后用三酮内酮溶液均匀地喷洒在滤纸有效面上，切勿喷得过多致使斑点扩散。然后将滤纸放入烘箱，于80℃下显色5min后取出。五、结果处理用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的R值，与标准氨基酸的Rr值对照，确定水解液中含有哪些氨基酸。六、注意事项1.点样时要避免手指或睡液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。2.点样斑点不能太大（直径应小于0.3cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。3.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。4．作为展层剂的正丁醇要重新蒸馏，甲酸须用分析纯的。且展层剂要临用前配制，以免发生酯化，影响层析结果。5.如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的R值十分接近时单向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用一种溶剂系统展层。滤纸取出干燥后，再将滤纸转90°角，用另一溶剂系统展层。所得图谱分别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各成分进行鉴定。七、思考题1.为什么点样时要避免手指或睡液等污染滤纸有效面？2.影响物质移动速率R值的因素有哪些？13
13 处划一条平行于底边的很轻的直线做为基线。沿直线以一定的间隔做标记以指示标准 氨基酸和蛋白质水解液的加样位置。用毛细管吸少量氨基酸样品点于标记的位置上。 点样时，毛细管口应与滤纸轻轻接触，样点直径一般控制在 0.3cm 之内。用吹风机稍 加吹干后再点下一次，重复 3 次，每次的样品点应完全重合。加样完毕后，将滤纸卷 成圆筒状，使基线吻合，两边不搭接，用针和线将纸两边缝合。将点好样品的滤纸移 入层析缸中（层析缸内事先加入一个注入 40ml 展层剂的直径为 10cm 的培养皿，使 液层厚度为 1cm 左右，盖上层析缸的盖子 20min，以保证罩内有一定蒸汽压），采用 上行法进行展层。当溶剂前沿上升到距纸上端 1cm 时，取出滤纸，立即用铅笔记下溶 剂前沿的位置，剪断缝线，用吹风机吹干滤纸上的溶剂。之后用茚三酮丙酮溶液均匀 地喷洒在滤纸有效面上，切勿喷得过多致使斑点扩散。然后将滤纸放入烘箱，于 80℃ 下显色 5min 后取出。 五、结果处理 用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间 的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的 Rf值，与标准氨基酸的 Rf值对照， 确定水解液中含有哪些氨基酸。 六、注意事项 1．点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。 2．点样斑点不能太大（直径应小于 0.3cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩散和 重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。 3．展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。 4．作为展层剂的正丁醇要重新蒸馏，甲酸须用分析纯的。且展层剂要临用前配 制，以免发生酯化，影响层析结果。 5．如果样品中溶质种类较多，且某些溶质在某一溶剂系统中的 Rf值十分接近时， 单向层析分离效果不佳，则可采用双向层析，即将样品点在一方形滤纸的角上，先用 一种溶剂系统展层。滤纸取出干燥后，再将滤纸转 90°角，用另一溶剂系统展层。所 得图谱分别与这两种溶剂系统中作的标准物质层析图谱对比，即可对混合物样品中各 成分进行鉴定。 七、思考题 1．为什么点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面？ 2．影响物质移动速率 Rf值的因素有哪些？
实验三蛋白质的粗提及含量测定（考马斯亮蓝G-250法）一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的提取和定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质的定量方法。考马斯亮蓝G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习蛋白质的粗提方法，掌握考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。二、原理蛋白质的粗提可通过研磨等细胞破碎方法使其从细胞组织中分离（具体见前面“生物大分子的制备”）。考马斯亮蓝G-250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质-色素结合物在595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。三、仪器、试剂和材料1.仪器（1）分析天平（2）具塞刻度试管10ml×8（3）吸管0.1mlx1，1mlx2，5mlx）（4）研钵（5）漏斗（6）离心管10ml（7）容量瓶10ml×1（8）离心机（9）分光光度计2.试剂14
14 实验三 蛋白质的粗提及含量测定（考马斯亮蓝 G-250 法） 一、目的 蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的 提取和定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比 较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，有多种蛋白质的定 量方法。考马斯亮蓝 G-250 法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏 度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习蛋白质的粗提方法，掌握 考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色 法中的应用。 二、原理 蛋白质的粗提可通过研磨等细胞破碎方法使其从细胞组织中分离（具体见前面 “生物大分子的制备”）。 考马斯亮蓝 G-250 是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为 青色。蛋白质含量在 0～1000μg 范围内，蛋白质-色素结合物在 595nm 下的吸光度与 蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）分析天平 （2）具塞刻度试管 10ml×8 （3）吸管 0.1ml×1，1ml×2，5ml×1 （4）研钵 （5）漏斗 （6）离心管 10ml （7）容量瓶 10ml×1 （8）离心机 （9）分光光度计 2．试剂
（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成100ug/ml的原液。（2）考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇中，加入85%（m/v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。此溶液在常温下可放置一个月。3.材料绿豆芽四、操作步骤1.蛋白质的粗提：准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馅水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r/min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定容至刻度。2.样品中蛋白质含量的测定（1）标准曲线的制作取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂管号12354600.20.40.60.8蛋白质标准液（ml）1.01.00.80.60.40.2蒸馏水（ml）055555考马斯亮蓝G-250试剂（ml)5020406080100蛋白质含量（μug）盖上塞子，摇匀。放置2min后在595nm波长下比色测定（比色应在Ih内完成）。以牛血清白蛋白含量（ug）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。（2）另1支具塞试管，准确加入0.1ml样品提取液，再加入0.9ml蒸馅水，5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595nm波长下比色，：记录吸光度。五、结果处理根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算：查得的蛋白质含量（ug）x提取液总体积（ml）样品蛋白质含量（ug/g鲜重）=样品鲜重（g）×测定时取用提取液体积（ml）15
15 （1）标准蛋白质溶液 称取 10mg 牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至 100ml， 制成 100μg／ml 的原液。 （2）考马斯亮蓝 G-250 蛋白试剂 称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250，溶于 50ml90% 乙醇中，加入 85%（m／v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。此溶液在 常温下可放置一个月。 3．材料 绿豆芽 四、操作步骤 1．蛋白质的粗提：准确称取约 200mg 绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入 5ml 蒸 馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入 10ml 容量瓶， 再向残渣中加入 2ml 蒸馏水，悬浮后再离心 10min，合并上清液，定容至刻度。 2．样品中蛋白质含量的测定 （1）标准曲线的制作 取 6 支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。 管号 1 2 3 4 5 6 蛋白质标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝 G-250 试剂（ml） 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100 盖上塞子，摇匀。放置 2min 后在 595nm 波长下比色测定（比色应在 lh 内完成）。 以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。 （2）另取 1 支具塞试管，准确加入 0.1ml 样品提取液，再加入 0.9ml 蒸馏水，5ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂，充分混合，放置 2min 后，以标准曲线 1 号试管做参比，在 595nm 波长下比色，记录吸光度。 五、结果处理 根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按 下式计算： 样品鲜重（ ） 测定时取用提取液体积（ ） 查得的蛋白质含量（ ） 提取液总体积（ ） 样品蛋白质含量（ 鲜重） g ml g ml g g × × = µ µ /
六、注意事项比色应在出现蓝色2min～lh内完成。七、思考题1.常用蛋白质的提取方法有哪些？各有何优缺点？2.考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？3.如何正确使用分光光度计？16
16 六、注意事项 比色应在出现蓝色 2min～lh 内完成。 七、思考题 1．常用蛋白质的提取方法有哪些？各有何优缺点？ 2．考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量 法？ 3．如何正确使用分光光度计？
实验四还原糖和总糖含量的测定（3，5-二硝基水杨酸比色法）一、 目的植物体内的还原糖，主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布，不仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是呼吸作用的基质。还原糖还能形成其他物质如有机酸等；此外，水果、蔬菜中含糖量的多少，也是鉴定其品质的重要指标。还原糖在有机体的代谢中起着重要的作用，其他碳水化合物，如淀粉、蔗糖等，经水解也生成还原糖。通过本实验，掌握还原糖定量测定的基本原理，学习比色定糖法的基本操作，熟悉分光光度计的使用方法。二、原理各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。在碱性条件下，还原糖与3，5-二硝基水杨酸共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在一定地围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。三、仪器、试剂和材料1.仪器（1）刻度试管：25ml×11（2）离心管或玻璃漏斗×2（3）烧杯：100ml×l（4）三角瓶：100ml×l（5）容量瓶：100ml×3（6）刻度吸管：1ml×l，2ml×4，10ml×l（7）恒温水浴（8）沸水浴（9）离心机（过滤法不用此设备）17
17 实验四 还原糖和总糖含量的测定（3，5-二硝基水杨酸比色法） 一、目的 植物体内的还原糖，主要是葡萄糖、果糖和麦芽糖。它们在植物体内的分布，不 仅反映植物体内碳水化合物的运转情况，而且也是呼吸作用的基质。还原糖还能形成 其他物质如有机酸等；此外，水果、蔬菜中含糖量的多少，也是鉴定其品质的重要指 标。还原糖在有机体的代谢中起着重要的作用，其他碳水化合物，如淀粉、蔗糖等， 经水解也生成还原糖。通过本实验，掌握还原糖定量测定的基本原理，学习比色定糖 法的基本操作，熟悉分光光度计的使用方法。 二、原理 各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可将植 物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多 糖彻底水解成有还原性的单糖。 在碱性条件下，还原糖与 3，5-二硝基水杨酸共热，3，5-二硝基水杨酸被还原为 3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红色物质），还原糖则被氧化成糖酸及其他产物。在一定地 围内，还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度成一定的比例关系，在 540nm 波长 下测定棕红色物质的消光值，查对标准曲线并计算，便可分别求出样品中还原糖和总 糖的含量。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 （1）刻度试管：25ml×11 （2）离心管或玻璃漏斗×2 （3）烧杯：100ml×l （4）三角瓶：100ml×1 （5）容量瓶：100ml×3 （6）刻度吸管：1ml×1，2m1×4，10ml×1 （7）恒温水浴 （8）沸水浴 （9）离心机（过滤法不用此设备）