生物化学实验教案2008一2009学年度第一学期
生物化学实验教案 2008—2009 学年度第 一 学期
试验一蛋白质显色反应和氨基酸纸层析（一）蛋自质的显色反应一、目的要求：1、理解蛋白质具有双缩脲反应。2、理解蛋白质和α--氨基酸均能与三酮作用产生有色化合物。3、了解氨基酸、蛋白质的某些侧链功能基团能发生黄色反应、米伦氏反应等显色反应。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：2学时。三、实验内容：蛋白质是由很多氨基酸通过特殊的结构而形成的，氨基酸以及这些特殊的结构与化学试剂作用而产生颜色，称呈色反应。蛋白质的呈色反应非常灵敏，常用作检验蛋白质和某些氨基酸的反应，也是定量测定的依据。<一、双缩脲反应：验证蛋白质具有双缩脲反应，能观察到蓝紫色的出现。1．取小量固体尿素，故在干燥小试管中，在弱火上加热，此时尿素溶融并放出氮，直到溶融物呈白色而坚硬的停止加热。2.冷却后，加入10%Na0H溶液1ml，摇匀溶解，再加入1%CuS04溶液5滴摇匀，观察颜色。3.取另一小试管，加入10%Na0H溶液1ml及1%CuS04溶液5滴，后逐滴加入1%卵清蛋白溶液，观察溶液颜色的变化。<二》、节三酮反应：验证蛋白质能与三酮作用产生蓝紫色化合物。1：取干净滤纸一小片，滴上1%酪氨酸溶液1滴，酒精灯上小火烘干。2.冷却后加1～2滴0.1%三酮酒精溶液，待酒精蒸发后烘干（注意勿着火），观察出现颜色。<三》、黄色蛋白反应：验证蛋白质的某些侧链功能基团能发生黄色反应（与浓HNO3反应）。1、取1%卵清蛋白1ml于溶液中，加浓硝酸（3一5）滴，此时出现蛋白质沉淀（为什么？），小心加热，观察沉淀颜色的变化。2、用自来水冷却试管，逐渐滴人40%Na0H溶液使之成为碱性，观察沉淀颜色的变化。四、作业：实验报告
试验一蛋白质显色反应和氨基酸纸层析 （一） 蛋白质的显色反应 一、 目的要求： 1、 理解蛋白质具有双缩脲反应。 2、 理解蛋白质和α-氨基酸均能与茚三酮作用产生有色化合物。 3、 了解氨基酸、蛋白质的某些侧链功能基团能发生黄色反应、米伦氏反应 等显色反应。 二、 教学方法和教学学时： 1、教学方法：学生操作实验，教师指导。 2、教学学时：2 学时。 三、 实验内容： 蛋白质是由很多氨基酸通过特殊的结构而形成的，氨基酸以及这些特殊的结 构与化学试剂作用而产生颜色，称呈色反应。蛋白质的呈色反应非常灵敏， 常用作检验蛋白质和某些氨基酸的反应，也是定量测定的依据。 <一>、双缩脲反应：验证蛋白质具有双缩脲反应，能观察到蓝紫色的出现。 l．取小量固体尿素，故在干燥小试管中，在弱火上加热，此时尿素溶融并 放出氮，直到溶融物呈白色而坚硬的停止加热。 2．冷却后，加入 10％NaOH 溶液 1ml，摇匀溶解，再加入 1％CuSO4溶液 5 滴， 摇匀，观察颜色。 3．取另一小试管，加入 10％NaOH 溶液 1ml 及 1％CuSO4溶液 5 滴，后逐滴加 入 1％卵清蛋白溶液，观察溶液颜色的变化。 <二>、茚三酮反应：验证蛋白质能与茚三酮作用产生蓝紫色化合物。 l．取干净滤纸一小片，滴上 1％酪氨酸溶液 1 滴，酒精灯上小火烘干。 2．冷却后加 l～2 滴 0.1％茚三酮酒精溶液，待酒精蒸发后烘干(注意勿着 火)，观察出现颜色。 <三>、黄色蛋白反应: 验证蛋白质的某些侧链功能基团能发生黄色反应（与 浓 HNO3反应）。 l、取 1％卵清蛋白 lml 于溶液中，加浓硝酸（3－5）滴，此时出现蛋白质沉 淀（为什么？），小心加热，观察沉淀颜色的变化。 2、用自来水冷却试管，逐渐滴人 40％NaOH 溶液使之成为碱性，观察沉淀颜 色的变化。 四、 作业：实验报告
(二）氨基酸的纸层析法分离一、目的要求：1、掌握分配层析分离技术的原理。2、掌握用纸上分配层析法分析氨基酸的方法。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：2学时。三、实验内容：以滤纸及其结合水作为固定相，以有机溶剂（正丁醇：醋酸：乙醇：水=4：1：1：2）作为流动相，分离混合氨基酸样品，并鉴定其成分。四、结果与分析：用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的R值，与标准氨基酸的R值对照，确定水解液中含有哪些氨基酸。（一）实验结果混合样品标准氨基酸亮氮谷氨酪组氮酸酸酸酸R成分计算公式：（二）分析结果：五、注意事项1.点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的部分）。2：点样斑点不能太大（直径应小于0.3cm），防止层析后氨基酸斑点过度散和重叠，用吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。3.展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。六、思考题1.为什么点样时要避免手指或睡液等污染滤纸有效面？2.影响物质移动速率R值的因素有哪些？七、作业：完成实验报告
（二） 氨基酸的纸层析法分离 一、目的要求： 1、 掌握分配层析分离技术的原理。 2、 掌握用纸上分配层析法分析氨基酸的方法。 二、教学方法和教学学时： 1、教学方法：学生操作实验，教师指导。 2、教学学时：2 学时。 三、实验内容： 以滤纸及其结合水作为固定相，以有机溶剂（正丁醇：醋酸：乙醇： 水=4：1：1：2）作为流动相，分离混合氨基酸样品，并鉴定其成分。 四、结果与分析： 用铅笔轻轻描出显色斑点的形状，并用一直尺度量每一显色斑点中心与原 点之间的距离和原点到溶剂前沿的距离，计算各色斑的 Rf值，与标准氨基 酸的 Rf值对照，确定水解液中含有哪些氨基酸。 （一）实验结果 混合样品 标准氨基酸 亮 氨 酸 谷 氨 酸 酪 氨 酸 组 氨 酸 Rf 成 分 计算公式： （二）分析结果： 五、注意事项 1．点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面（即展层时样品可能达到的 部分）。 2．点样斑点不能太大（直径应小于 0.3cm），防止层析后氨基酸斑点过度扩 散和重叠，且吹风温度不宜过高，否则斑点变黄。 3．展层开始时切勿使样品点浸入溶剂中。 六、思考题 1．为什么点样时要避免手指或唾液等污染滤纸有效面？ 2．影响物质移动速率 Rf值的因素有哪些？ 七、作业：完成实验报告
实验三蛋白质的粗提及含量测定（考马斯亮蓝G-250法）一、目的要求：1、掌握蛋白质粗提方法。2、掌握考马斯亮蓝G一250法样品蛋白含量的原理。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：4学时。三、实验内容：1.蛋白质的粗提：2．样品中蛋白质含量的测定（1）标准曲线的制作取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。1管号2356400. 20. 40.60. 81. 0蛋白质标准液（ml）01. 00. 80. 60. 40. 2蒸馏水（ml）555555考马斯亮蓝G-250试剂（m1）020406080100蛋白质含量（μg）盖上塞子，摇匀。放置2min后在595nm波长下比色测定（比色应在1h内完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。（2）另取1支具塞试管，准确加入0.1m1样品提取液，再加入0.9ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G-250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595nm波长下比色，记录吸光度。四、结果处理根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（ug），按下式计算：查得的蛋白质含量（μug）x提取液总体积（ml）样品蛋白质含量（μug/g鲜重）=样品鲜重（g）x测定时取用提取液体积（ml）五、注意事项比色应在出现蓝色2min～1h内完成。六、思考题1.常用蛋白质的提取方法有哪些？各有何优缺点？2.考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？3.如何正确使用分光光度计？七、作业：完成实验报告
实验三 蛋白质的粗提及含量测定（考马斯亮蓝 G-250 法） 一、 目的要求： 1、 掌握蛋白质粗提方法。 2、 掌握考马斯亮蓝 G－250 法样品蛋白含量的原理。 二、 教学方法和教学学时： 1、 教学方法：学生操作实验，教师指导。 2、 教学学时：4 学时。 三、 实验内容： 1．蛋白质的粗提： 2．样品中蛋白质含量的测定 （1）标准曲线的制作 取 6 支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。 管号 1 2 3 4 5 6 蛋白质标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝 G-250 试剂（ml） 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量（μg） 0 20 40 60 80 100 盖上塞子，摇匀。放置 2min 后在 595nm 波长下比色测定（比色应在 lh 内完 成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。 （2）另取 1 支具塞试管，准确加入 0.1ml 样品提取液，再加入 0.9ml 蒸馏 水，5ml 考马斯亮蓝 G-250 试剂，充分混合，放置 2min 后，以标准曲线 1 号试 管做参比，在 595nm 波长下比色，记录吸光度。 四、结果处理 根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg）， 按下式计算： 样品鲜重（ ） 测定时取用提取液体积（ ） 查得的蛋白质含量（ ） 提取液总体积（ ） 样品蛋白质含量（ 鲜重） g ml g ml g g × × = µ µ / 五、注意事项 比色应在出现蓝色 2min～lh 内完成。 六、思考题 1．常用蛋白质的提取方法有哪些？各有何优缺点？ 2．考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定 量法？ 3．如何正确使用分光光度计？ 七、作业：完成实验报告
实验四还原糖和总糖含量的测定（3，5-二硝基水杨酸比色法）目的要求：一1、掌握用硝基水杨酸比色法测定样品中总糖和还原糖含量。2、掌握总糖和还原糖的提取方法。二、教学方法和教学学时：1、教学方法：学生操作实验，教师指导。2、教学学时：5学时。三、实验内容：1、制作葡萄糖标准曲线2、以面粉为材料，50℃水浴提取还原糖：用硝基水杨酸比色法测定出还原糖的含量。3、取食用面粉，酸解法制备总糖水解液；用硝基水杨酸比色法测定出总糖的含量。四、结果与分析：（一）糖的定量测定结果管号还原糖测定管号总糖测定管号①②III还原糖待测液（ml）1111总糖待测液（ml）1111蒸馏水（ml）1. 51.53,5-二硝基水杨酸1. 51.5(ml)计算公式：提取液总体积查曲线所得还原糖质量（mg）>测定时取用体积×100还原糖%=样品质量（mg）查曲线所得水解后还原糖质量（mg)x稀释倍数×100总糖%=样品质量（mg）（二）结果分析：1、面粉中主要含有何种糖？2、在提取糖时，其他杂质是否会影响到测定？3、分析操作误差和偶然误差。五、注意事项标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。六、思考题
实验四 还原糖和总糖含量的测定（3，5-二硝基水杨酸比色法） 一、目的要求： 1、掌握用硝基水杨酸比色法测定样品中总糖和还原糖含量。 2、掌握总糖和还原糖的提取方法。 二、教学方法和教学学时： 1、教学方法：学生操作实验，教师指导。 2、教学学时：5 学时。 三、实验内容： 1、制作葡萄糖标准曲线 2、以面粉为材料，500 C 水浴提取还原糖；用硝基水杨酸比色法测定出还原糖的 含量。 3、取食用面粉，酸解法制备总糖水解液；用硝基水杨酸比色法测定出总糖的含 量。 四、结果与分析： （一）糖的定量测定结果 管号 还原糖测定管号 总糖测定管号 ① ② I II 还原糖待测液（ml） 1 1 总糖待测液（ml） 1 1 蒸馏水（ml） 1 1 1 1 3,5- 二硝基水杨酸 (ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 计算公式： % ×100 × = 样品质量（ ） 测定时取用体积 提取液总体积 查曲线所得还原糖质量（ ） 还原糖 mg mg % ×100 × = 样品质量（ ） 查曲线所得水解后还原糖质量（ ） 稀释倍数 总糖 mg mg （二） 结果分析： 1、面粉中主要含有何种糖？ 2、在提取糖时，其他杂质是否会影响到测定？ 3、分析操作误差和偶然误差。 五、注意事项 标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色。 六、思考题