（1）试管（×2)：（2）酒精灯：（3）移液管1ml(×1)：（4）试管架(×1)；（5）药（×1)。3.试剂（1）尿素（CP)；（2）10%NaOH；（3）1%CuSO4溶液。（三）操作步骤1.取小量固体尿素，故在干燥小试管中，在弱火上加热，此时尿素溶融并放出氮，直到溶融物呈白色而坚硬的停止加热。2.冷却后，加入10%NaOH溶液1ml，摇匀溶解，再加入1%CuSO4溶液5滴，摇匀，观察颜色。3.取另一小试管，加入10%NaOH溶液1ml及1%CuSO4溶液5滴，后逐滴加入1%卵清蛋白溶液，观察溶液颜色的变化。二、三酮反应（一）原理-切蛋白质及α-氨基酸均能与节三酮作用产生紫色化合物，此反应常用来检验蛋白质及氨基酸的存在。HOH加热+ RCOOH+RCHO +NH3 +CO2OHOHNH2OO水合三酮还原型水合节三酮HO2NH3OHHOO0ONH4C3H,0O0蓝色缩合物（二）材料、仪器和试剂1.材料1%酪氨酸溶液8
8 （1）试管 (×2)；（2）酒精灯；（3）移液 管 1ml(×1)；（4）试管架(×1)；（5）药匙 (×1)。 3．试剂 （1）尿素（CP）；（2）10％NaOH；（3）1％CuSO4溶液。 （三）操作步骤 l．取小量固体尿素，故在干燥小试管中，在弱火上加热，此时尿素溶融并放出 氮，直到溶融物呈白色而坚硬的停止加热。 2．冷却后，加入 10％NaOH 溶液 1ml，摇匀溶解，再加入 1％CuSO4 溶液 5 滴， 摇匀，观察颜色。 3．取另一小试管，加入 10％NaOH 溶液 1ml 及 1％CuSO4 溶液 5 滴，后逐滴加 入 1％卵清蛋白溶液，观察溶液颜色的变化。 二、茚三酮反应 （一）原理 一切蛋白质及 α-氨基酸均能与茚三酮作用产生紫色化合物，此反应常用来检验蛋 白质及氨基酸的存在。 C C O O C OH OH R C COOH H NH2 + C C O O C H OH + RCHO +NH + 3 CO2 水合茚三酮 加热 还原型水合茚三酮 C C O O C HO HO + C C O O C H OH + 2NH3 + C C ONH4 O C N C O O C C 3H2O 蓝色缩合物 （二）材料、仪器和试剂 1．材料 1％酪氨酸溶液
2.仪器（1）滤纸片；（2）酒精灯。3.试剂0.1%节三酮酒精溶液（三）操作步骤1.取干净滤纸一小片，滴上1%酪氨酸溶液1滴，酒精灯上小火烘干。2.冷却后加1～2滴0.1%三酮酒精溶液，待酒精蒸发后烘干（注意勿着火），观察出现颜色。三、黄色蛋白反应（一）原理浓硝酸使含苯环的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸氧化为黄色硝基化合物，若再加碱，此黄色化合物变为桔黄色硝醒酸化合物，凡不含苯环氨基酸的蛋白质，如鱼精蛋白，则无此反应，其它蛋白质均有此反应。OHOH00NO2+HNO3-0'Na*+NaOH-H0-HOCH2CH-COOHCH2—-CH-COOHCH2--CH-COOHNH2NH2NH2（二）材料、仪器及试剂1.材料1%卵清蛋白溶液2.仪器（1）试管（×1）：（2）酒精灯：（3）试管架；（4）移液管1ml（×1）3.试剂（1）浓硝酸（CP）；（2）40%NaOH溶液（三）操作步骤1、取1%卵清蛋白Iml于溶液中，加浓硝酸（3~5）滴，此时出现蛋白质沉淀（为什么？），小心加热，观察沉淀颜色的变化。2、用自来水冷却试管，逐渐滴人40%NaOH溶液使之成为碱性，观察沉淀颜色的变化。四、米隆氏反应（Millon）（一）原理蛋白质中如有酪氨酸则可与米隆试剂反应（含有亚硝酸的硝酸汞溶液），产生暗9
9 2．仪器 （1）滤纸片；（2）酒精灯。 3．试剂 0.1％茚三酮酒精溶液 （三）操作步骤 l．取干净滤纸一小片，滴上 1％酪氨酸溶液 1 滴，酒精灯上小火烘干。 2．冷却后加 l～2 滴 0.1％茚三酮酒精溶液，待酒精蒸发后烘干(注意勿着火)，观 察出现颜色。 三、黄色蛋白反应 （一）原理 浓硝酸使含苯环的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸氧化为黄色硝基化合物，若再加碱， 此黄色化合物变为桔黄色硝醌酸化合物，凡不含苯环氨基酸的蛋白质，如鱼精蛋白， 则无此反应，其它蛋白质均有此反应。 OH CH2 CH NH2 COOH OH CH2 CH NH2 COOH NO2 O N O O- COOH NH2 CH2 CH Na + HNO3 H2O NaOH + _ + _ H2O （二）材料、仪器及试剂 l．材料 1％卵清蛋白溶液 2．仪器 （1）试管（×1）；（2）酒精灯；（3）试管架；（4）移液管 1ml（×1） 3．试剂 （1）浓硝酸（CP）；（2）40％NaOH 溶液 （三）操作步骤 l、取 1％卵清蛋白 lml 于溶液中，加浓硝酸（3～5）滴，此时出现蛋白质沉淀（为 什么？），小心加热，观察沉淀颜色的变化。 2、用自来水冷却试管，逐渐滴人 40％NaOH 溶液使之成为碱性，观察沉淀颜色 的变化。 四、米隆氏反应（Millon） （一）原理 蛋白质中如有酪氨酸则可与米隆试剂反应（含有亚硝酸的硝酸汞溶液），产生暗
红色的汞比合物。酚也有同样的反应。米隆反应是酚类物质的反应，蛋白质由于含有酪氨酸，故有此反应。HOCH2—CH-COOH + HO-N=ONH2HOCH—CH-COOH + HONH2N-OHgNO;-CH-COOHHO-CH-COOHCH-CH—NH2NH2N-0'HgN-O凡不含酪氨酸的蛋白质，如白明胶等不产生米隆氏反应。（二）材料、仪器及试剂1.材料（1）1%卵清蛋白：（2）1%酪氨酸溶液：（3）1%白明胶。2.仪器（1）试管（x3）；（2）酒精灯。3.试剂米隆氏试剂：取汞40g溶于比重1.42的硝酸57ml，冷却后在水浴中使之溶解，加二倍蒸馏水稀释之，待澄清后，取上层清液使用。（三）操作步骤1.取试管三只，分别加入1%卵蛋白10滴和1%酪氨酸溶液10滴。2．二管分别加入米隆试剂5滴，小火加热，注意颜色变化。3.以1%白明胶溶液按上述操作做米隆氏反应，观察结果。10
10 红色的汞比合物。酚也有同样的反应。米隆反应是酚类物质的反应，蛋白质由于含有 酪氨酸，故有此反应。 HO CH2 CH COOH NH2 + HO N O HO CH2 CH COOH NH2 N O + H2O O CH2 CH COOH NH2 N OHO CH2 CH COOH NH2 N O Hg + HgNO3 凡不含酪氨酸的蛋白质，如白明胶等不产生米隆氏反应。 （二）材料、仪器及试剂 l．材料 （1）1％卵清蛋白；（2）1％酪氨酸溶液；（3）1％白明胶。 2．仪器 （1）试管（×3）；（2）酒精灯。 3．试剂 米隆氏试剂：取汞 40g 溶于比重 1.42 的硝酸 57ml，冷却后在水浴中使之溶解， 加二倍蒸馏水稀释之，待澄清后，取上层清液使用。 （三）操作步骤 l．取试管二只，分别加入 1％卵蛋白 10 滴和 1％酪氨酸溶液 10 滴。 2．二管分别加入米隆试剂 5 滴，小火加热，注意颜色变化。 3．以 1％白明胶溶液按上述操作做米隆氏反应，观察结果
实验二蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离一、目的1.学习水解蛋白质的方法。2.掌握纸层析的基本技术。3.学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法二、原理1.蛋白质的水解蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基酸。实验室中常使用酸解法水解蛋白质。当在6mol/L盐酸溶液中将蛋白质在110℃加热大约20h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为L-氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质一一腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。2.纸层析法分离氨基酸纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的分配系数是一个常数，若以K表示分配系数溶质在固定相中的浓度K=溶质在流动相中的浓度层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分，一般达滤纸重的22%左右（其中约有6%的水与纤维素结合成复合物），由于这部分水扩散作用降低形成固定相：而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸的毛细管中自由流动，形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相间进行分配。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离。11
11 实验二 蛋白质的水解和氨基酸的纸层析法分离 一、目的 1．学习水解蛋白质的方法。 2．掌握纸层析的基本技术。 3．学习用纸层析分离、鉴定氨基酸的方法。 二、原理 1．蛋白质的水解 蛋白质可以用酸、碱或酶如胃蛋白酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶水解成最终产物氨基 酸。实验室中常使用酸解法水解蛋白质。当在 6mol／L 盐酸溶液中将蛋白质在 110℃ 加热大约 20h，肽键断裂，此时蛋白质完全分解为氨基酸。 酸法水解蛋白质的优点是在水解过程中不发生外消旋作用，所得到的氨基酸均为 L-氨基酸。大多数氨基酸在煮沸酸中是稳定的，但色氨酸则完全被破坏。丝氨酸和苏 氨酸在酸解过程中或多或少地也有破坏。色氨酸的水解产物已知是一种棕黑色的物质 ——腐黑质，因此，用酸法水解蛋白质得到的水解液为棕黑色的。 2．纸层析法分离氨基酸 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析法。它利用不同物质在同一推动剂中具有不同 的分配系数，经层析而达到分离的目的。在一定条件下，一种物质在某溶剂系统中的 分配系数是一个常数，若以 K 表示分配系数 溶质在流动相中的浓度 溶质在固定相中的浓度 K = 层析溶剂（又称推动剂），是选用有机溶剂和水组成的。滤纸纤维素与水有较强 的亲和力（纤维素分子的葡萄糖基上的-OH 基与水通过氢键相作用）能吸附很多水分， 一般达滤纸重的 22％左右（其中约有 6％的水与纤维素结合成复合物），由于这部分 水扩散作用降低形成固定相；而推动剂中的有机溶剂与滤纸的亲和力很弱，可在滤纸 的毛细管中自由流动，形成流动相。层析时，点有样品的滤纸一端浸入推动剂中，有 机溶剂连续不断地通过点有样品的原点处，使其上的溶质依据本身的分配系数在两相 间进行分配。随着有机溶剂不断向前移动，溶质被携带到新的无溶质区并继续在两相 间发生可逆的重新分配，同时溶质离开原点不断向前移动，溶质中各组分的分配系数 不同，前进中出现了移动速率差异，通过一定时间的层析，不同组分便实现了分离
物质的移动速率以R值表示：原点到层析点中心的距离R,=4原点到溶剂前沿的距离各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的R值，借此可以达到分离、定性、鉴别的目的。溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH值、滤纸质地以及层析温度、时间等都会影响R值。三、仪器试剂和材料1.仪器（1）干燥箱（2）水浴锅（3）安瓶（4）层析缸（5）吹风机（6）喷雾器2.试剂(1)6mol/LHCI（2）标准氨基酸（1mg/ml)：称取亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、颉氨酸、组氨酸各1mg，分别溶于1ml0.01mol/L的HCI溶液中，保存于冰箱。（3）展层剂：正丁醇：88%甲酸：水=15：3：2（V/V）（4）0.5%的三酮丙酮溶液（5）10%异丙醇溶液3.材料（1）层析滤纸（10cm×10cm），普通滤纸（21cmx21cm）（2）毛细管、培养皿、镊子四、操作步骤1.蛋白质的水解称取0.2g酵母粉，放进一个小安瓶中，向瓶中加入1ml6mol/L的盐酸，于喷灯火焰上封口。将安部瓶放入干燥箱内，在110℃下水解20h后，把安颜瓶内的水解液倒进蒸发血内，将蒸发皿放于沸水浴上加热以除去水解液中的盐酸。将水解液蒸干，溶解于0.5～1ml10%异丙醇中。2.纸层析法分离氨基酸取1张10×10cm的层析滤纸放在普遍滤纸上，用直尺和铅笔在距滤纸底边2cm12
12 物质的移动速率以 Rf值表示： 原点到溶剂前沿的距离 原点到层析点中心的距离 Rf = 各种化合物在恒定条件下，层析后都有其一定的 Rf 值，借此可以达到分离、定 性、鉴别的目的。 溶质的结构与极性、溶剂系统的物质组成与比例、pH 值、滤纸质地以及层析温 度、时间等都会影响 Rf值。 三、仪器试剂和材料 1．仪器 （1）干燥箱 （2）水浴锅 （3）安瓿瓶 （4）层析缸 （5）吹风 机 （6）喷雾器 2．试剂 （1）6mol／LHCl （2）标准氨基酸（1mg／ml）：称取亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、颉氨酸、组氨 酸各 1mg，分别溶于 1ml0.01mol/L 的 HCl 溶液中，保存于冰箱。 （3）展层剂：正丁醇：88%甲酸：水=15：3：2（V／V） （4）0.5％的茚三酮丙酮溶液 （5）10％异丙醇溶液 3．材料 （1）层析滤纸（10cm×10cm），普通滤纸（21cm×21cm） （2）毛细管、培养皿、镊子 四、操作步骤 l．蛋白质的水解 称取 0.2g 酵母粉，放进一个小安瓿瓶中，向瓶中加入 1ml6mol/L 的盐酸，于喷 灯火焰上封口。将安瓿瓶放入干燥箱内，在 110℃下水解 20h 后，把安瓿瓶内的水解 液倒进蒸发皿内，将蒸发皿放于沸水浴上加热以除去水解液中的盐酸。将水解液蒸干， 溶解于 0.5～1ml10%异丙醇中。 2．纸层析法分离氨基酸 取 1 张 10×10cm 的层析滤纸放在普遍滤纸上，用直尺和铅笔在距滤纸底边 2cm