DNA片段被插入到由同一种限制性内切酶剪切过的质粒或病毒载体里。第三步骤：克隆以质粒或病毒为载体，将DNA片段引入到细胞中一通常是细菌（见图19.5）。每当一个细胞繁殖的时候，它将形成一个克隆，其中的每一个细胞都含有携带着DNA片段的载体。每一个克隆都被单独保存，所有的克隆共同组成一个供体DNA的克隆文库（clonelibrary）。第四步骤：筛选(screening)含有某个人们所需要的特定的DNA片段（通常是含有某个特殊基因的片段）的克隆被从克隆文库里筛选出来。这通常是所有基因工程实验中最具挑战性的部分，因此我们将详细的介绍这一步骤。4-I：克隆的初步筛选研究者们首先把所有不含载体的克隆和所含载体中没有供体DNA片段的克隆从文库里清除出去。通过使用特殊的载体一一含有能对特定抗生素（比如四环素（tetracycline），青霉素(penicillin)或氨苄青霉素(ampicillin))产生抗性的基因的载体一一可以将不含载体的克隆清除。在图19.6a中，amp基因被插入到质粒中，并产生抗氨苄青霉素抗性。当把克隆暴露在含有抗生素的培养基中时，只有含有载体的克隆才能抵抗抗生素，从而生存下来。有一种清除所含载体中没有供体DNA片段的克隆的方法，是使用一种不仅含抗生素抗性基因还含生产β一半乳糖苷酶(β一galactosidase）（这种酶使细胞能代谢X一半乳糖）所必需的lacZ基因的载体。X一半乳糖的代谢造成了一种蓝色反应产物的生成，因此任何一个细胞，只要它的载体中含有这种有功能的基因，都将在有X一半乳糖存在时变蓝（图19.6b）。然而，如果对其使用一种识别序列位于lacZ基因内部的限制性内切酶，重组DNA产生时这个基因将被切断，细胞也将不能再代谢X一半乳糖。因此，所含载体中有供体DNA片段的克隆将在X一半乳糖的存在下保持无色。任何一个能在含抗生素的培养基里生存，但在含X一半乳糖的培养基里不变蓝的细胞，一定是插入了含供体DNA片段的载体的。克隆筛选的下一步是找出
DNA 片段被插入到由同一种限制性内切酶剪切过的质粒或病毒载体里。 第三步骤：克隆 以质粒或病毒为载体，将 DNA 片段引入到细胞中―通常是细菌（见图 19.5）。 每当一个细胞繁殖的时候，它将形成一个克隆，其中的每一个细胞都含有携带着 DNA片段的载体。每一个克隆都被单独保存，所有的克隆共同组成一个供体DNA 的克隆文库（clone library）。 第四步骤：筛选(screening) 含有某个人们所需要的特定的 DNA 片段（通常是含有某个特殊基因的片段） 的克隆被从克隆文库里筛选出来。这通常是所有基因工程实验中最具挑战性的部 分，因此我们将详细的介绍这一步骤。 4－I：克隆的初步筛选 ：克隆的初步筛选 研究者们首先把所有不含载体的克隆和所含载体中没有供体 DNA 片段的克 隆从文库里清除出去。通过使用特殊的载体――含有能对特定抗生素(比如四环 素（tetracycline），青霉素(penicillin)或氨苄青霉素(ampicillin))产生抗性的基因 的载体――可以将不含载体的克隆清除。在图 19.6a 中，amp r 基因被插入到质粒 中，并产生抗氨苄青霉素抗性。当把克隆暴露在含有抗生素的培养基中时，只有 含有载体的克隆才能抵抗抗生素，从而生存下来。 有一种清除所含载体中没有供体 DNA 片段的克隆的方法，是使用一种不仅 含抗生素抗性基因还含生产β－半乳糖苷酶(β－galactosidase)（这种酶使细胞 能代谢 X－半乳糖）所必需的 lacZ’基因的载体。X－半乳糖的代谢造成了一种 蓝色反应产物的生成，因此任何一个细胞，只要它的载体中含有这种有功能的基 因，都将在有 X－半乳糖存在时变蓝（图 19.6b）。然而，如果对其使用一种识别 序列位于 lacZ’基因内部的限制性内切酶，重组 DNA 产生时这个基因将被切断， 细胞也将不能再代谢 X－半乳糖。因此，所含载体中有供体 DNA 片段的克隆将 在 X－半乳糖的存在下保持无色。 任何一个能在含抗生素的培养基里生存，但在含 X－半乳糖的培养基里不变 蓝的细胞，一定是插入了含供体 DNA 片段的载体的。克隆筛选的下一步是找出
lac Z'geneBacterial cell that did nottakeup plasmid(functional)lacZ'gene(nonfunctional)SeFragmentDNA-amprgeneGene of interestColony withBacterial cell withoutColoniesEliminatecellsrecombinantrecombinantDNAwithwithoutplasmidDNAplasmidIdentifycellswithoutrecombinantX-galDNAin mediaAmpicillin inmediaCells that did not takeupthe plasmidCellsthat didnottake up DNAfragmentshavefunctionallacZarenotresistanttoampicillinanddogenes,areableto metabolizenotform colonies onmedia containingX-gal,andturn blueon mediathis antibiotic.that contain X-gal.图19.6使用抗生素抗性和X一半乳糖对克隆进行初步筛选。细菌被插入一种重组质粒，该质粒含有一个氨青霉素抗性基因（ampr）和一个产生β一半乳糖苷酶所必需的基因（lacZ），这种酶使细胞能消化X一半乳糖，结果产生的菌落变蓝。a.没有吸收质粒的细胞对氨青霉素没有抗性，不能在含抗生素的培养基上形成菌落。b.没有吸收DNA片段的细胞含有功能的lacZ'基因，能消化X一半乳糖，并在含X一半乳糖的培养基上变蓝。Bacterial cell that did not take up plasmid没有吸收质粒的细菌细胞LacZ'gene(functional）LacZ基因（有功能）LacZ'gene（nonfunctional）LacZ'基因（无功能）ampgeneamp基因fragmentof DNADNA片段geneofinterest目的基因eliminatecellswithout plasmid除去不含质粒的细胞BacterialcellwithoutrecombinantDNA不含重组DNA的细菌细胞colonywithrecombinant DNA含重组DNA的克隆colonieswithplasmid含质粒的克隆IdentifycellswithoutrecombinantDNA鉴别出不含重组DNA的细胞ampicillininmedia含氨苄青霉素的培养基X-galinmedia含X-半乳糖的培养基cells thatdidnottakeuptheplasmid are notresistanttoampicillinand donotform colonies onmedia containing this antibiotic没有吸收质粒的细胞对氨苄青霉素没有抗性，在含这种抗生素的培养基上不形成克隆。CellsthatdidnottakeupDNAfragmentshavefunctionallacZ'genes,areabletometabolizeX-gal,and turnblueonmedia that containX-gal.没有吸收DNA片段的细胞的lacZ基因有功能，能够代谢X-半乳糖，并在含X-半乳糖的培养基上变蓝
图 19.6 使用抗生素抗性和 X－半乳糖对克隆进行初步筛选。细菌被插入一种重组质粒，该质粒 含有一个氨苄青霉素抗性基因（ampr）和一个产生β－半乳糖苷酶所必需的基因（lacZ’）， 这种酶使细胞能消化 X－半乳糖，结果产生的菌落变蓝。 a.没有吸收质粒的细胞对氨苄青霉素没有抗性，不能在含抗生素的培养基上形成菌落。 b.没有吸收 DNA 片段的细胞含有功能的 lacZ’基因，能消化 X－半乳糖，并在含 X－半 乳糖的培养基上变蓝。 Bacterial cell that did not take up plasmid 没有吸收质粒的细菌细胞 LacZ’ gene (functional) LacZ’基因（有功能） LacZ’ gene (nonfunctional) LacZ’ 基因（无功能） fragment of DNA DNA 片段 amp r gene amp r 基因 gene of interest 目的基因 eliminate cells without plasmid 除去不含质粒的细胞 Bacterial cell without recombinant DNA 不含重组 DNA 的细菌细胞 colony with recombinant DNA 含重组 DNA 的克隆 colonies with plasmid 含质粒的克隆 Identify cells without recombinant DNA 鉴别出不含重组 DNA 的细胞 ampicillin in media 含氨苄青霉素的培养基 X-gal in media 含 X-半乳糖的培养基 cells that did not take up the plasmid are not resistant to ampicillin and do not form colonies on media containing this antibiotic 没有吸收质粒的细胞对氨苄青霉素没有抗性，在含这种抗生素的培养基上不形成克隆。 Cells that did not take up DNA fragments have functional lacZ’ genes, are able to metabolize X-gal, and turn blue on media that contain X-gal. 没有吸收 DNA 片段的细胞的 lacZ’基因有功能，能够代谢 X-半乳糖，并在含 X-半乳糖 的培养基上变蓝
含有特定供体DNA片段的细胞。4一I：找出目的基因一个克隆文库可能包括几十到好几千个供体DNA片段。这些片段中有许多可能是相同的，因此，要构建一个包含完整的供体基因组的克隆文库，就需要几十万个克隆。以一个完整的果蝇基因库为例，它含有超过40000个不同的克隆。一个由20000碱基大小的片段组成的完整的人类基因库估计需要近一百万个克隆。要在这样一个巨大的克隆文库中寻找包含对应某个特殊基因片段的克隆需要独创性，但是许多不同的方法已经取得了成功。在克隆文库里筛选，以找到特定基因的最普遍的方法是杂交（hybridization）。（图19.7）在这种技术中，被克隆的基因与另一段核酸上的互补序列形成碱基对，该互补核酸被称为探针（probe)，因为它用来探测目的基因的存在。要制作一个探针，至少要有一部分目的基因的核苷酸序列是已知的。在这种筛选技术中，含有插入基因的细菌菌落生长在琼脂上。一些细胞被转移到压在菌落上的滤纸上，形成了一个平板的复本。滤纸随后用一种能降解细菌DNA，并含有放射性标记探针的溶液进行处理。探针与细胞DNA中的互补单链序列杂交。当把滤纸放在照相胶片上时，有放射性的区域将使胶片感光（放射自显影autoradiography）。只有含目的基因的菌落能与放射性探针杂交，并使胶片感光。然后将胶片上的图案与原先平板上的图案相比较，就一定能找出含目的基因的菌落。基因工程通常包括四个步骤：剪切供体DNA：制备重组体：克隆重组体：在克隆中筛选目的基因。筛选可以通过使所需要的克隆对某些抗生素产生抗性，并给它们一些其他的有利于鉴别的性质来实现
含有特定供体 DNA 片段的细胞。 4－II：找出目的基因 ：找出目的基因 一个克隆文库可能包括几十到好几千个供体 DNA 片段。这些片段中有许多 可能是相同的，因此，要构建一个包含完整的供体基因组的克隆文库，就需要几 十万个克隆。以一个完整的果蝇基因库为例，它含有超过 40000 个不同的克隆。 一个由 20000 碱基大小的片段组成的完整的人类基因库估计需要近一百万个克 隆。要在这样一个巨大的克隆文库中寻找包含对应某个特殊基因片段的克隆需要 独创性，但是许多不同的方法已经取得了成功。 在克隆文库里筛选，以找到特定基因的最普遍的方法是杂交（hybridization）。（图 19.7）在这种技术中，被克隆的基因与另一段核酸上的互补序列形成碱基对，该 互补核酸被称为探针（probe），因为它用来探测目的基因的存在 ） 。要制作一个探 针，至少要有一部分目的基因的核苷酸序列是已知的。 在这种筛选技术中，含有插入基因的细菌菌落生长在琼脂上。一些细胞被转 移到压在菌落上的滤纸上，形成了一个平板的复本。滤纸随后用一种能降解细菌 DNA，并含有放射性标记探针的溶液进行处理。探针与细胞 DNA 中的互补单链 序列杂交。 当把滤纸放在照相胶片上时，有放射性的区域将使胶片感光（放射自显影 autoradiography）。只有含目的基因的菌落能与放射性探针杂交，并使胶片感光。 然后将胶片上的图案与原先平板上的图案相比较，就一定能找出含目的基因的菌 落。 基因工程通常包括四个步骤：剪切供体 DNA；制备重组体；克隆重组体； 在克隆中筛选目的基因。筛选可以通过使所需要的克隆对某些抗生素产生抗性 。筛选可以通过使所需要的克隆对某些抗生素产生抗性， 并给它们一些其他的有利于鉴别的性质来实现
5.Acomparisonwiththeoriginal2.Areplicaoftheplateidentifiesthecolonyplateis madecontainingthegene.bypressingafilteragainstthecolonies.Somecellsfromeachcolony adhereto the filter.1.Coloniesofplasmid-containingbacteria,eachfromaclonefromtheclonelibrary,aregrownonagar.FilterFilm.Thefilteriswashedwitha4.Onlythosecoloniessolution that denatures thecontainingthe geneDNA and containstheradio-will retaintheprobeactivelylabeledprobe.Theand emitradioactivityprobecontainsnucleotideonfilmplacedoverseguencescomplementarytothefilterthegeneofinterestandbindsto cells containingthegene.图19.7步骤4一IⅡI：用杂交来鉴别目的基因。（1）这些细菌培养平血上的每一个菌落都代表了由单个细胞繁殖产生的数百万个克隆。为了检测一个特定的基因是否包含在某个特定的克隆里，就必须鉴别出其DNA能和包含与该基因互补DNA序列的探针杂交的细胞。（2）把一张滤纸压在母平板上，使每一个菌落中的一些细胞粘附在滤纸上。（3）滤纸随后用-种能使细菌DNA变性，并含有放射性标记探针的溶液进行处理。（4）只有那些含能与探针杂交的DNA，即目的基因的菌落，能在射线自显影中使胶片感光。（5）然后将胶片上的图案与母平板上的图案相比较，以鉴别出含目的基因的菌落。1. Colonies of plasmid-containingbacteria, eachfrom the clone library,are grown on agar.含质粒的细菌菌落生长在琼脂上，每一个菌落来自于克隆文库的一个克隆。2.Areplica oftheplateismadebypressingafilteragainstthecolonies.Somecellsfromeachcolony adhere to the filter.把滤纸压在菌落上，以制得平板的拷贝。每一个菌落中的一些细胞粘附在滤纸上。3. The filter is washed with a solution that denatures the DNA and contains the radioactivitylabeled probe.Theprobe contains nucleotide sequencescomplementarytothegeneof interestandbindstocells containingthegene.滤纸用一种能使细菌DNA变性，并含有放射性标记探针的溶液洗涤。探针含与目的基因互补的核苷酸序列，能与含目的基因的细胞相结合。4.Only those colonies containing thegenewill retain theprobe and emitradioactivityonfilmplaced over the filter.只有含目的基因的菌落能与探针相结合，并使放在滤纸上的胶片感光。5.Acomparisonwiththeoriginal plate identifiesthecolony containingthegene.将胶片与母平板作比较，即可鉴别出含目的基因的菌落
图 19.7 步骤 4－II：用杂交来鉴别目的基因 ：用杂交来鉴别目的基因。（1）这些细菌培养平皿上的每一个菌落都代表了由 单个细胞繁殖产生的数百万个克隆。为了检测一个特定的基因是否包含在某个特定的克 隆里，就必须鉴别出其 DNA 能和包含与该基因互补 DNA 序列的探针杂交的细胞。（2） 把一张滤纸压在母平板上，使每一个菌落中的一些细胞粘附在滤纸上。（3）滤纸随后用 一种能使细菌 DNA 变性，并含有放射性标记探针的溶液进行处理。（4）只有那些含能与 探针杂交的 DNA，即目的基因的菌落，能在射线自显影中使胶片感光。（5）然后将胶片 上的图案与母平板上的图案相比较，以鉴别出含目的基因的菌落。 1. Colonies of plasmid-containing bacteria, each from the clone library, are grown on agar. 含质粒的细菌菌落生长在琼脂上，每一个菌落来自于克隆文库的一个克隆。 2. A replica of the plate is made by pressing a filter against the colonies. Some cells from each colony adhere to the filter. 把滤纸压在菌落上，以制得平板的拷贝。每一个菌落中的一些细胞粘附在滤纸上。 3. The filter is washed with a solution that denatures the DNA and contains the radioactivity labeled probe. The probe contains nucleotide sequences complementary to the gene of interest and binds to cells containing the gene. 滤纸用一种能使细菌 DNA 变性，并含有放射性标记探针的溶液洗涤。探针含与目的基因 互补的核苷酸序列，能与含目的基因的细胞相结合。 4. Only those colonies containing the gene will retain the probe and emit radioactivity on film placed over the filter. 只有含目的基因的菌落能与探针相结合，并使放在滤纸上的胶片感光。 5. A comparison with the original plate identifies the colony containing the gene. 将胶片与母平板作比较，即可鉴别出含目的基因的菌落
基因克隆的处理一旦一个基因被成功的克隆出来后，有许多方法可以用来检测它的特征。得到足够供检测用的DNA：聚合酶链式反应一旦从DNA片段库里鉴别出了目的基因，就需要进行大规模复制。其中有一种方法是把鉴别出来的片段插入到细菌里，经过持续的细胞分裂后，将能得到几百万个含有该片段的细胞。然而，还有一种方法要简捷的多，就是用DNA聚合酶通过聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)(PCR,图19.8）来复制目的基因。KaryMullis在1983年发明了PCR，那时他是一名化学家，受雇于Cetus公司。1993年，这项发明使Target sequence回日回口他获得了诺贝尔化日PHeat primers学奖。PCR能扩增特DenaturationCool定的序列，或者把一Cycle<卫②Annealingofprimers1DNApolymerase些序列（比如限制性+?Freenucleotidescopies节③Primerextension内切酶识别序列）作PHeat为引物来克隆DNA。CycleCool4copies2PCR包括三个步骤：PE一Heat步骤1：变性。Cool8copiesCycle首先，将过量的P3F引物（通常为20P到30核苷酸长图19.8度的人工合成序聚合酶链式反应。（1）变性。加热含引物和待扩增DNA片列）和需要被扩段的溶液，以使DNA解离成单链。（2）退火。冷却溶液，引物与DNA片段的互补序列在要扩增的区域旁配对。（3）增的DNA片段延伸。接下来，DNA聚合酶由引物起开始复制每一条链的剩混合。将这种引余部分。然后重复步骤1到3。这一过程重复多遍，每一次都使拷贝的数量加倍，直到产生足够供实验用的拷贝。物与DNA片段Target sequence目标序列heat加热cool冷却的混合物加热到primer引物Denaturation变性cycle循环annealingofprimers引物退火大约98℃。在这DNApolymerasefreenucleotidesDNA聚合酶游离核苷酸个温度下，双链拷贝引物扩增copiesprimerextension
基因克隆的处理 一旦一个基因被成功的克隆出来后，有许多方法可以用来检测它的特征。 得到足够供检测用的 DNA：聚合酶链式反应 ：聚合酶链式反应 一旦从 DNA 片段库里鉴别出了目的基因，就需要进行大规模复制。其中有一种 方法是把鉴别出来的片段插入到细菌里，经过持续的细胞分裂后，将能得到几百 万个含有该片段的细胞。然而，还有一种方法要简捷的多，就是用 DNA 聚合酶 通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)（PCR,图 19.8）来复制目的基因。 Kary Mullis 在 1983 年发明了 PCR，那时他是一名化学家，受雇于 Cetus 公司。 1993 年，这项发明使 他获得了诺贝尔化 学奖。PCR 能扩增特 定的序列，或者把一 些序列（比如限制性 内切酶识别序列）作 为引物来克隆 DNA。 PCR 包括三个步骤： 步骤 1：变性。 首先，将过量的 引物（通常为 20 到 30 核苷酸长 度的人工合成序 列）和需要被扩 增的 DNA 片段 混合。将这种引 物与 DNA 片段 的混合物加热到 大约 98oC。在这 个温度下，双链 图 19.8 聚合酶链式反应。（1）变性。加热含引物和待扩增 DNA 片 段的溶液，以使 DNA 解离成单链。（2）退火。冷却溶液， 引物与 DNA 片段的互补序列在要扩增的区域旁配对。（3） 延伸。接下来，DNA 聚合酶由引物起开始复制每一条链的剩 余部分。然后重复步骤 1 到 3。这一过程重复多遍，每一次 都使拷贝的数量加倍，直到产生足够供实验用的拷贝。 Target sequence 目 标 序 列 heat 加 热 cool 冷 却 primer 引物 Denaturation 变性 annealing of primers 引物退火 cycle 循环 DNA polymerase free nucleotides DNA 聚合酶 游离核苷酸 copies 拷贝 primer extension 引物扩增