使用限制性内切酶操作基因基米拉（chimera）是神话里的一种生物，它有狮子的头，羊的身体和蛇的尾巴。尽管自然界里并不存在这样的生物，但生物学家已经通过基因工程，制造了一种更为细微的基米拉。构建pSC101第一批基米拉中，有一个是美国遗传学家斯坦利·科恩（StanleyCohen）和赫伯特·波尔（HerbentBoyer）在1973年，用一种叫做抗性转移因子的细菌质粒制造出来的。科恩和波尔使用了从大肠杆菌中得到的一种叫做EcoRI的限制性内切酶，来把质粒剪切成片段。其中有一个9000核苷酸大小的片段，包含有复制的起始点和四环素抗性基因。因为这个片段的两个未端是被同一个限制性内切酶切断的，它们可以连接成环，形成一个较小的质粒，即科恩命名的pSC101。用pSC101生成重组DNA科恩和波尔还使用EcoRI来剪切从一种成体两栖类动物一一非洲爪蟾（Xenopuslaevis）中得到的编码rRNA的DNA，并将得到的爪蟾DNA的片段和由EcoRI重新打开的pSC101质粒混合，然后让细菌细胞从混合物中吸收DNA（图19.3）。有些细菌细胞立刻获得了对四环素的抗性，这说明它们把pSC101质粒与自已的抗生素抗性基因合并了。而且，有些含pSC101的细菌也开始产生爪蟾RNA！科恩和波尔推断，爪蟾rRNA基因一定是被插入到了这些细菌的pSC101质粒中。换句话说，被EcoRI切开的pSC101质粒的两端，已经和同样被EcoRI切开的，含有rRNA基因的爪蟾DNA片段的两端结合。含有爪蟾rRNA基因的pSC101质粒是一个真正的基米拉，一个自然界中从未出现过，也永远不会通过自发的方式产生出来的一个全新的基因组。它是一利重组DNA（recombinantDNA）一一也就是在实验室里，通过将来自不同基因组的片段彼此结合产生新组合，从而创造出来的DNA
使用限制性内切酶操作基因 基米拉（chimera）是神话里的一种生物 ） ，它有狮子的头，羊的身体和蛇的 尾巴。尽管自然界里并不存在这样的生物，但生物学家已经通过基因工程，制造 了一种更为细微的基米拉。 构建 pSC101 第一批基米拉中，有一个是美国遗传学家斯坦利·科恩（Stanley Cohen）和 赫伯特·波尔（Herbent Boyer）在 1973 年，用一种叫做抗性转移因子的细菌质 粒制造出来的。科恩和波尔使用了从大肠杆菌中得到的一种叫做 EcoRI 的限制性 内切酶，来把质粒剪切成片段。其中有一个 9000 核苷酸大小的片段，包含有复 制的起始点和四环素抗性基因。因为这个片段的两个末端是被同一个限制性内切 酶切断的，它们可以连接成环，形成一个较小的质粒，即科恩命名的 pSC101。 用 pSC101 生成重组 DNA 科恩和波尔还使用 EcoRI 来剪切从一种成体两栖类动物――非洲爪蟾 （Xenopus laevis）中得到的编码 ） rRNA 的 DNA，并将得到的爪蟾 DNA 的片段 和由 EcoRI 重新打开的 pSC101 质粒混合，然后让细菌细胞从混合物中吸收 DNA （图 19.3）。有些细菌细胞立刻获得了对四环素的抗性，这说明它们把 pSC101 质粒与自己的抗生素抗性基因合并了。而且，有些含 pSC101 的细菌也开始产生 爪蟾 RNA！科恩和波尔推断，爪蟾 rRNA 基因一定是被插入到了这些细菌的 pSC101 质粒中。换句话说，被 EcoRI 切开的 pSC101 质粒的两端，已经和同样 被 EcoRI 切开的，含有 rRNA 基因的爪蟾 DNA 片段的两端结合。 含有爪蟾 rRNA 基因的 pSC101 质粒是一个真正的基米拉，一个自然界中从 未出现过，也永远不会通过自发的方式产生出来的一个全新的基因组。它是一种 重组 DNA（recombinant DNA）――也就是在实验室里，通过将来自不同基因 组的片段彼此结合产生新组合，从而创造出来的 DNA
EndonucleaseEcoRlCleaveamphibianDNAwithrestrictionendonucleaseEcoRl.AmphibianDNArRNACleaveplasmidgenepSC101withEcoRl.PlasmidpSC101Recom-Cleavedplasmidbinanttetrgeneiscombinedwithplasmidamphibianfragment.图19.3最早的基因工程实验之一。本图展示了科恩和波尔如何将编码rRNA的两栖动物基因插入到pSC101中。质粒只有一个供限制性内切酶EcoRI剪切的位点；它还包含了tet，种能产生对抗生素四环素产生抗性的基因。通过EcoRI剪切两栖动物DNA和质粒，并使互补序列配对，而把rRNA编码基因插入到pSC101中。EndonucleaseEcoRI限制性内切酶EcoRIamphibianDNA两栖动物DNAcleaveamphibianDNAwithrestrictionendonucleaseEcoRI用限制性内切酶EcoRI剪切两栖动物DNArRNAgenerRNA基因PlasmidpSC101：质粒pSC101cleaveplasmidpSC101withEcoRI用限制性内切酶EcoRI剪切pSC101质粒tet genetet'基因Recombinantplasmid重组质粒cleavedplasmid iscombinedwithamphibianfragment被剪切过的质粒与两栖动物DNA片段的接合其它载体将外源DNA片段引入到宿主细胞在分子遗传学中已经是很普遍的了。将外源基因运送到宿主细胞中的基因组叫做载体（vectors）。像pUC18这类质粒，可以被诱导产生成百上千个自身的拷贝，同时也就是成百上千个它们所携带的外源基因的拷贝。更大的DNA片段可以用YACs（酵母细胞人工染色体）代替质粒作为载体来引入。不是所有的载体都以细菌为目标。比如，人类流感病毒一一腺
其它载体 将外源 DNA 片段引入到宿主细胞在分子遗传学中已经是很普遍的了。将外 源基因运送到宿主细胞中的基因组叫做载体（vectors）。像 pUC18 这类质粒，可 以被诱导产生成百上千个自身的拷贝，同时也就是成百上千个它们所携带的外源 基因的拷贝。更大的 DNA 片段可以用 YACs（酵母细胞人工染色体）代替质粒 作为载体来引入。不是所有的载体都以细菌为目标。比如，人类流感病毒――腺 图 19.3 最早的基因工程实验之一。本图展示了科恩和波尔如何将编码 。 rRNA 的两栖动物基因插 入到 pSC101 中。质粒只有一个供限制性内切酶 EcoRI 剪切的位点；它还包含了 tetr，一 种能产生对抗生素四环素产生抗性的基因。通过 EcoRI 剪切两栖动物 DNA 和质粒，并 使互补序列配对，而把 rRNA 编码基因插入到 pSC101 中。 Endonuclease EcoRI 限制性内切酶 EcoRI amphibian DNA 两栖动物 DNA cleave amphibian DNA with restriction endonuclease EcoRI用限制性内切酶EcoRI剪切两栖 动物 DNA rRNA gene rRNA 基因 Plasmid pSC101 质粒 pSC101 cleave plasmid pSC101 with EcoRI 用限制性内切酶 EcoRI 剪切 pSC101 质粒 tetr gene tetr 基因 Recombinant plasmid 重组质粒 cleaved plasmid is combined with amphibian fragment 被剪切过的质粒与两栖动物 DNA 片段的接合
病毒之类的动物病毒，是作为将基因引入到猴子和人体等真核细胞的载体，而动物基因也曾入到植物细胞中破引基因操作实例Herman，神奇的牛抗枯菱的花乙烯，使果实成熟的植物激素，同样能使花加利福尼亚的一家生物技术公司GenPharm枯萎。Purdue的研究者们发现了花孵应答乙培育出了Herman，一头拥有人类乳铁蛋白（HLF）基因的牛，乳铁蛋白在人体中有抗烯而调落的基因，把它替换为一个对乙烯不敏感的基因。他们培育出的转基因康乃馨在菌和铁运输等作用。Herman的许多雕性后被剪掉后能维持三个星期不枯萎，而普通的代能生产含有乳铁蛋白的牛奶。GenPhar打算建立这种转基因牛的群体，用来大规康乃馨只能维持三天。模的生产乳铁蛋白抗象鼻虫的豌豆基因工程不仅被用来控制田间农业病毒和害电，宅它还在储藏方面提供了一种控制害虫的方法。美国和澳大利亚的科学家们制造出了种只在豌豆种子超级鲜鱼里表达的基因。加拿大渔业科学家们将重组生长激素基这种基因编码的酶抑制素能阻止象鼻虫侵因插入到正在发育的鲑鱼胚胎里，培养出蚀豌豆。而象鼻虫是对仓储粮食危害最大了第一条转基因鲜鱼。这些鲜鱼不但生长的害电之一。由于仓储粮食中有高达百分周期缩短了·而且它们平均比非转基因之四十被昆虫吃掉，这项发明将在全球范鱼重11倍！这对于渔业和全球范围的食围内产生重大影响。品业的意义是很明显的。第一批用基因工程产生的重组基因组中，有一个是将两栖动物的RNA编码基因插入到细菌质粒中形成的。病毒也可以用作载体，将外源DNA插入到宿主
病毒之类的动物病毒，是作为将基因引入到猴子和人体等真核细胞的载体，而动 物 基 因 也 曾 被 引 入 到 植 物 细 胞 中 。 第一批用基因工程产生的重组基因组中，有一个是将两栖动物的 RNA 编码 基因插入到细菌质粒中形成的。病毒也可以用作载体，将外源 DNA 插入到宿主
细胞中，产生重组基因组。19.2基因工程涉及简单的可理解性程序基因工程实验的四个步骤就像科恩和波尔的实验一样，大多数的基因工程实验DNAandrestriction包括四个步骤：endonucleaseTDNA剪切，重(b)组 DNA 的制Cathode备，克隆和筛Longerfragment:选。PowersourceTGel-Shorter第一步骤：DNAfragment:GlaSsMixtureofDNAAnodeCompleted gel剪切platesfragments ofElectriccurrentapplied,fragmentsmigratedifferentsizesindowntheaelbvsize-smaller.onesmovesolutionplacedat thetop of"lanes"faster(and thereforegofarther)than larger(a)人们使用onesinthegel图19.4限制性内切酶凝胶电泳。（a）限制性内切酶剪切DNA以后，把得到的片段加到凝胶来把DNA剪切上，按通电流。DNA片段移动通过凝胶，其移动速度与大小成反比。因成片段。因为内为用溴化乙啶染色过后，移动的条带在紫外照射下能发出荧光，这些片切酶的识别序段很容易看到。（b）在照片里，DNA的一条带被从凝胶上切下来，用于列可能在供体进一步的分析。我们能看见它正在技术员拿着的试管里发光。DNA上多次出DNAandrestrictionendonucleaseDNA和限制性内切酶cathode负极现，剪切将产生anode正极Gel电泳胶glassplates玻璃板许多不同的片longerfragments较长片段shorterfragments较短片段completedgel电泳后的电泳胶段。使用识别不MixtureofDNAfragmentsof different sizesin solutionplacedatthetopof"lanes"inthe同序列的内切gel含有不同大小DNA片段的混合物的溶液被加到电泳胶各泳道的顶端Electric current applied, fragments migratedown the gel by size-smaller酶，将得到一套onesmovefaster(and thereforegofarther)thanlargerones接通电流，各片段根据各自大小沿胶向下移动一一小片段比大片段移动快（因此也移动的更远）
细胞中，产生重组基因组。 19.2 基因工程涉及简单的可理解性程序 基因工程实验的四个步骤 就 像 科 恩 和波尔的实验 一样，大多数的 基因工程实验 包括四个步骤： DNA 剪切，重 组 DNA 的 制 备，克隆和筛 选。 第一步骤：DNA 剪切 人 们 使 用 限制性内切酶 来把 DNA 剪切 成片段。因为内 切酶的识别序 列可能在供体 DNA 上多次出 现，剪切将产生 许多不同的片 段。使用识别不 同序列的内切 酶，将得到一套 图 19.4 凝胶电泳。（a）限制性内切酶剪切 DNA 以后，把得到的片段加到凝胶 上，按通电流。DNA 片段移动通过凝胶，其移动速度与大小成反比。因 为用溴化乙啶染色过后，移动的条带在紫外照射下能发出荧光，这些片 段很容易看到。（b）在照片里，DNA 的一条带被从凝胶上切下来，用于 进一步的分析。我们能看见它正在技术员拿着的试管里发光。 DNA and restriction endonuclease DNA 和限制性内切酶 cathode 负极 anode 正极 Gel 电泳胶 glass plates 玻璃板 longer fragments 较长片段 shorter fragments 较短片段 completed gel 电泳后的电泳胶 Mixture of DNA fragments of different sizes in solution placed at the top of “lanes” in the gel 含有不同大小 DNA 片段的混合物的溶液被加到电泳胶各泳道的顶端 Electric current applied, fragments migrate down the gel by size—smaller ones move faster(and therefore go farther)than larger ones 接通电流，各片段根据各自大小沿胶向下移动――小片段比大片段移动 快（因此也移动的更远）
不同的片段。这些片段，根据它们的大小不同可以通过电泳而彼此分离（图19.4）。第二步骤：制备重组DNAStage1:DNAfromtwo sources lsAnimaRestrictioendonucleasE.colcutsitesGeneOrestRegenePlasmidDNAThetwotypesnlPEDNAligasDNAandplasmidsAlacZ'qeneae9OCOOa1O?OQaOOEOOOO#Clone3CloneClone2Tostage4Partof a clone libraryClonesarescreenedforgeneofinteres图19.5基因工程实验的四个步骤。在第一步骤里，包含目的基因的DNA（在这里，DNA来自于动物）和质粒DNA被同一种限制性内切酶剪切。ampr和lacZr基因也被包括到质粒里，用来筛选克隆（第四步骤）。在第二步骤里，两段被剪切的DNA被混合到一起，其粘性末端互相配对。在第三步骤里，重组DNA被插入到细菌细胞中，该细胞繁殖后代，形成克隆。在第四步骤里，筛选克隆，以找到目的基因。animalcell动物细胞Restrictionendonucleasecutsites限制性内切酶剪切位点plasmid质粒amp’geneamp’基因lacZ'geneLacZ基因Restrectionsite限制性位点粘性末端geneofinterest目的基因stickyendsRecombinantDNAandplasmids重组DNA和质粒nonfunctional lacZgene无功能的LacZ'基因partofaclonelibrary克隆文库的一部分Stage1:DNAfrom two sources is isolated and cleaved with the same restriction endonuclease.第一阶段：两种来源的DNA被分离出来，并用同一种限制性内切酶剪切Stage 2:The two types of DNA can pair at their sticky ends when mixed together, DNA ligasejoinsthesegments第二阶段：当两种DNA混合在一起时，它们能在它们的粘性末端处配对：然后DNA连接酶将各片段连接起来。stage 3:Plasmids are inserted into bacterial cells by transformation, bacterial cells reproduceandformclones第三阶段：质粒通过转化被插入到细菌细胞里；细菌细胞复制繁殖，形成克隆。tostage4:clonesarescreenedforgeneofinterest.到第四阶段：克隆被用来筛选目的基因
不同的片段。这些片段，根据它们的大小不同可以通过电泳而彼此分离（图 19.4）。 第二步骤：制备重组 DNA 图 19.5 基因工程实验的四个步骤。在第一步骤里 。 ，包含目的基因的 DNA（在这里，DNA 来自 于动物）和质粒 DNA 被同一种限制性内切酶剪切。ampr 和 lacZr 基因也被包括到质粒里， 用来筛选克隆（第四步骤）。在第二步骤里，两段被剪切的 DNA 被混合到一起，其粘性 末端互相配对。在第三步骤里，重组 DNA 被插入到细菌细胞中，该细胞繁殖后代，形成 克隆。在第四步骤里，筛选克隆，以找到目的基因。 animal cell 动物细胞 Restriction endonuclease cut sites 限制性内切酶剪切位点 lacZ’ gene LacZ’基因 plasmid 质粒 amp r gene amp r 基因 gene of interest 目的基因 Restrection site 限制性位点 sticky ends 粘性末端 Recombinant DNA and plasmids 重组 DNA 和质粒 nonfunctional lacZ’ gene 无功能的 LacZ’基因 part of a clone library 克隆文库的一部分 Stage 1:DNA from two sources is isolated and cleaved with the same restriction endonuclease. 第一阶段：两种来源的 DNA 被分离出来，并用同一种限制性内切酶剪切 Stage 2:The two types of DNA can pair at their sticky ends when mixed together; DNA ligase joins the segments 第二阶段：当两种 DNA 混合在一起时，它们能在它们的粘性末端处配 对；然后 DNA 连接酶将各片段连接起来。 stage 3:Plasmids are inserted into bacterial cells by transformation; bacterial cells reproduce and form clones 第三阶段：质粒通过转化被插入到细菌细胞里；细菌细胞复制繁殖，形 成克隆。 to stage 4:clones are screened for gene of interest. 到第四阶段：克隆被用来筛选目的基因