2．仪器或其他用具试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力牛角匙，高压蒸汽灭菌锅、pH试纸（pH6.8~8.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。四、操作步骤（详细内容见《微生物学实验》）1.称量2.溶化4.过滤3.调pH5.分装(1）液体分装(2）固体分装(3）半固体分装6.加塞7.包扎8.灭菌9.搁置斜面10.无菌检查Ⅲ消毒与灭菌（详细内容见《微生物学实验》）消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）两者的意义有所不同。消毒一般指消灭病原体和有害微生物的营养体而言，灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等方法。一、加热法又分为干热灭菌和湿热灭菌两类。1.干热灭菌2.湿热灭菌（1）高压蒸汽灭菌法（2）常压蒸气灭菌法（3）煮沸消毒法（4）超高温杀菌二、过滤除菌三、辐射灭菌四、化学药品灭菌4
4 2. 仪器或其他用具 试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装 器，扭力牛角匙，高压蒸汽灭菌锅、 pH 试纸 (pH6.8~8.0)，棉花，牛皮纸， 记号笔，麻绳，纱布等。 四、操作步骤 （详细内容见《微生物学实验》） 1．称量 2．溶化 3．调 pH 4．过滤 5．分装 (1) 液体分装 (2) 固体分装 (3) 半固体分装 6．加塞 7. 包扎 8. 灭菌 9. 搁置斜面 10．无菌检查 Ⅲ 消毒与灭菌 （详细内容见《微生物学实验》） 消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）两者的意义有所不同。消毒一般 指消灭病原体和有害微生物的营养体而言，灭菌则是指杀灭一切微生物的营养 体、芽孢和孢子。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使 用化学药品等方法。 一、加热法 又分为干热灭菌和湿热灭菌两类。 1． 干热灭菌 2． 湿热灭菌 （1） 高压蒸汽灭菌法 （2） 常压蒸气灭菌法 （3） 煮沸消毒法 （4） 超高温杀菌 二、过滤除菌 三、辐射灭菌 四、化学药品灭菌
实验二水产动物微生物病原的分离与纯化一、目的要求1.掌握倒平板的方法和了解几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。2.掌握平板分离法。二、基本原理（详细内容见《微生物学实验》）从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有：简易单细胞挑取法和平板分离法。三、器材1.培养基牛肉膏蛋白陈琼脂培养基。2.溶液或试剂无菌水，无菌生理盐水。3.水产动物患细菌性疾病的水产动物（鱼、虾等4.仪器或其他用具无菌吸管，接种环，酒精灯，无菌培养血，显微镜，解剖工具等。四、操作步骤（详细内容见《微生物学实验》）1倒平板、将牛肉膏蛋白陈琼脂培养基加热溶化，待冷至5560℃时倒入无菌培养皿，即成平板。倒平板的方法：（详细内容见《微生物学实验》）2.划线（详细内容见《微生物学实验》）水产动物病灶部位细菌的分离：分离鱼体表面的病原菌：取病灶部分小片，接种于适当的培养基使它发育，或直接用接种环挑取病灶组织在固体平板培养基中进行划线分离。分离其他器官和组织内的病原菌：用浸过0.1%升汞或75%酒精的纱布覆盖体表，进行鱼体表面消毒。若为内部器官，如肠、肝、肾等则用无菌手续部开腹部后，取出病变器官，用灼热铁片或解部刀片烫器官或组织表面后，再用接种环取出其里面材料进行划线分离。3.挑菌落一般在28~35℃下培养18～24h后，挑取形态一致的单个优势菌落再进行划线分离培养，直至获得纯化的菌株，最后转种到营养琼脂斜面保存，备用。5
5 实验二 水产动物微生物病原的分离与纯化 一、目的要求 1. 掌握倒平板的方法和了解几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术。 2. 掌握平板分离法。 二、基本原理 （详细内容见《微生物学实验》） 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微 生物的分离与纯化。常用的方法有：简易单细胞挑取法和平板分离法。 三、器材 1．培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。 2．溶液或试剂 无菌水，无菌生理盐水。 3. 水产动物 患细菌性疾病的水产动物（鱼、虾等） 4．仪器或其他用具 无菌吸管，接种环，酒精灯，无菌培养皿，显微 镜，解剖工具等。 四、操作步骤 （详细内容见《微生物学实验》） 1. 倒平板 将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基加热溶化，待冷至 55～60℃时倒 入无菌培养皿，即成平板。倒平板的方法：（详细内容见《微生物学实验》） 2. 划线 （详细内容见《微生物学实验》） 水产动物病灶部位细菌的分离： 分离鱼体表面的病原菌：取病灶部分小片，接种于适当的培养基使它发育， 或直接用接种环挑取病灶组织在固体平板培养基中进行划线分离。 分离其他器官和组织内的病原菌：用浸过 0.1%升汞或 75%酒精的纱布覆 盖体表，进行鱼体表面消毒。若为内部器官，如肠、肝、肾等则用无菌手续剖 开腹部后，取出病变器官，用灼热铁片或解剖刀片烫器官或组织表面后，再用 接种环取出其里面材料进行划线分离。 3. 挑菌落 一般在 28~35℃下培养 18～24h 后，挑取形态一致的单个优 势菌落再进行划线分离培养，直至获得纯化的菌株，最后转种到营养琼脂斜面 保存，备用
实验三人工感染试验一、目的要求掌握对水产动物人工感染的操作方法。二、基本原理将从水产动物病灶部位分离的纯培养，分别接种于新鲜的琼脂斜面上，28℃恒温培养16～20h后，用无菌生理盐水洗下菌苔，制成菌悬液，以McF3管（或在显微镜下用血球计数板直接计数，也可用光比浊计数法计数）对菌悬液浓度进行估算，使得最后菌悬液的浓度为1~9×10°cfu/m1。后接种到健康水产动物中，进行感染试验。在试验期间（一般为1～2周）观察被感染的水产动物发病情况是否与自然发病症状一致，旨在进一步确定所分离的细菌是否为该种水产动物的致病菌。人工感染试验的接种方法有浸泡、口服、注射、涂抹等。究竟选用哪一种方法最合适，需要根据不同疾病类型和可能的侵入途径而定。如体表的病，可采用浸泡法；是体内的病，可采用口服、注射等。本实验着重介绍注射法。经过多次反复试验（包括再分离再感染）后，根据其出现的病症，便可知其所分离的细菌是否具有致病性，然后经一系列的形态和培养特征观察、生理生化反应测定等来确定其分类位置或属何种细菌，并通过药敏试验确定采用何种药物进行预防和治疗，为水产养殖者提供科学依据。三、器材1.健康水产动物鱼、虾等（注：与分离病原菌的水产动物一致）。2.仪器或其他用具显微镜，解部镜；灭菌生理盐水，注射器，针头，镊子，消毒煮沸器，碘酒棉花或酒精棉花，解剖盘，纱布及玻璃器皿，麦氏比浊管等。四、操作步骤1.注射器的准备与消毒（1）选择大小适当而针筒与筒心号码一致的注射器，并先吸入清水，试其是否漏水，漏水的注射器不能使用，因其注射量不准确，而且注射材料可能6
6 实验三 人工感染试验 一、目的要求 掌握对水产动物人工感染的操作方法。 二、基本原理 将从水产动物病灶部位分离的纯培养，分别接种于新鲜的琼脂斜面上， 28℃恒温培养 16～20h 后，用无菌生理盐水洗下菌苔，制成菌悬液，以 McF3 管（或在显微镜下用血球计数板直接计数，也可用光比浊计数法计数）对菌悬 液浓度进行估算，使得最后菌悬液的浓度为 1~9×108 cfu /ml。后接种到健康 水产动物中，进行感染试验。在试验期间（一般为 1～2 周）观察被感染的水 产动物发病情况是否与自然发病症状一致，旨在进一步确定所分离的细菌是否 为该种水产动物的致病菌。 人工感染试验的接种方法有浸泡、口服、注射、涂抹等。究竟选用哪一种 方法最合适，需要根据不同疾病类型和可能的侵入途径而定。如体表的病，可 采用浸泡法；是体内的病，可采用口服、注射等。本实验着重介绍注射法。 经过多次反复试验（包括再分离再感染）后，根据其出现的病症，便可知 其所分离的细菌是否具有致病性，然后经一系列的形态和培养特征观察、生理 生化反应测定等来确定其分类位置或属何种细菌，并通过药敏试验确定采用何 种药物进行预防和治疗，为水产养殖者提供科学依据。 三、器材 1. 健康水产动物 鱼、虾等（注：与分离病原菌的水产动物一致）。 2. 仪器或其他用具 显微镜，解剖镜；灭菌生理盐水，注射器，针头， 镊子，消毒煮沸器，碘酒棉花或酒精棉花，解剖盘，纱布及玻璃器皿，麦氏比 浊管等。 四、操作步骤 1．注射器的准备与消毒 （1）选择大小适当而针筒与筒心号码一致的注射器，并先吸入清水，试 其是否漏水，漏水的注射器不能使用，因其注射量不准确，而且注射材料可能
为病原菌，会污染环境。（2）视选择的动物及注射途径之不同而选用不同长短大小的针头，并先试验是否通气或漏水（由于市售针头大小的编号比较混乱，本实验一般用老编号或直接用长短表示）。（3）消毒时将筒心从针筒中拔出，用一块纱布先包针筒，后包筒心，并使两者在纱布内的方向一致，包好后，置煮沸消毒器中。选好的针头包以纱布，置煮沸消毒器之另一端。同时放入镊子一把，加入自来水，以淹没注射器为度煮沸消毒10分钟。（4）消毒完毕后，用镊子取出注射器，置筒心于针筒中，并将针头牢固地装于注射器的针嘴上，使针头的斜面与针筒上的刻度在一条直线上。（5）吸入注射材料，并将注射器内的空气排尽，若注射材料具有传染性，则排气时应以消毒棉花包扎住针头，以免传染材料外溢而污染环境。准备注射。目前，一般用一次性注射器，上述操作可以不进行。2．菌悬液的准备（1）吸取灭菌的生理盐水约5ml，注入预先培养的菌斜面培养物上，将菌苔洗下。（2）用无菌吸管吸取洗下菌液，注入无菌小试管或小烧杯中。（3）取一与比浊管同质量的小试管，加洗下的菌液约1ml，再加生理盐水4ml（或更多，视原菌液浓度而定），混均后与各比浊管比浊，使其与第3管的浊度相近，菌浓度约为1～9×10°cfu/ml，记下所用生理盐水的量。（4）稀释用生理盐水将洗下的原菌液稀释至每毫升含菌为1~9×10°cfu/ml。2.注射（1）为了实验进行更顺利，在注射时，一般需要两个人进行，助手将预先暂养一周左右的实验动物（鱼）抓住放入解部盘内的纱布上，一手抓住头部一手抓住尾部，将鱼体背部向上。注意不能让鱼进行挣扎，以免在注射时将鱼体皮肤划伤。7
7 为病原菌，会污染环境。 （2）视选择的动物及注射途径之不同而选用不同长短大小的针头，并先 试验是否通气或漏水（由于市售针头大小的编号比较混乱，本实验一般用老编 号或直接用长短表示）。 （3）消毒时将筒心从针筒中拔出，用一块纱布先包针筒，后包筒心，并 使两者在纱布内的方向一致，包好后，置煮沸消毒器中。选好的针头包以纱布， 置煮沸消毒器之另一端。同时放入镊子一把，加入自来水，以淹没注射器为度， 煮沸消毒 10 分钟。 （4）消毒完毕后，用镊子取出注射器，置筒心于针筒中，并将针头牢固 地装于注射器的针嘴上，使针头的斜面与针筒上的刻度在一条直线上。 （5）吸入注射材料，并将注射器内的空气排尽，若注射材料具有传染性， 则排气时应以消毒棉花包扎住针头，以免传染材料外溢而污染环境。准备注射。 目前，一般用一次性注射器，上述操作可以不进行。 2．菌悬液的准备 （1） 吸取灭菌的生理盐水约 5ml，注入预先培养的菌斜面培养物上，将 菌苔洗下。 （2） 用无菌吸管吸取洗下菌液，注入无菌小试管或小烧杯中。 （3） 取一与比浊管同质量的小试管，加洗下的菌液约 1ml，再加生理盐 水 4ml（或更多，视原菌液浓度而定），混均后与各比浊管比浊，使其与第 3 管的浊度相近，菌浓度约为１～9×108 cfu/ml，记下所用生理盐水的量。 （4）稀释 用生理盐水将洗下的原菌液稀释至每毫升含菌为 1~9×108 cfu /ml。 2. 注射 （1）为了实验进行更顺利，在注射时，一般需要两个人进行，助手将预 先暂养一周左右的实验动物（鱼）抓住放入解剖盘内的纱布上，一手抓住头部， 一手抓住尾部，将鱼体背部向上。注意不能让鱼进行挣扎，以免在注射时将鱼 体皮肤划伤
（2）注射者用以灭菌的注射器吸入稀释好的菌液，并赶走注射器内的气泡，准备注射。（3）注射前先用碘酒棉花或酒精棉花消毒鱼体背部皮肤，注射者以预先准备好的带针头（可用4号）的注射器（内装稀释后的菌液），刺入被消毒处的肌肉，注射0.2ml/尾的菌悬液。注射时要缓缓推动筒心，不能太快。然后拔出注射器，再次用碘酒棉花或酒精棉花消毒鱼体被注射处。（4）为了使实验数据更有说服力，还应用生理盐水注射相同数量（用菌液注射的鱼体尾数）的鱼体，设为对照组，注射方法同上一步骤。3.观察注射完后将鱼体放入水体，对其进行常规的管理（一般应进行1～2周，随时进行观察，看是否有病症出现，如有，记录病症，并与自然发病症状比较，如果症状一致，说明注射菌具有致病性（在条件充许的情况下，应对其进行细菌的重分离，以便进一步的研究）；否则，说明注射菌可能不具有致病性。8
8 （2）注射者用以灭菌的注射器吸入稀释好的菌液，并赶走注射器内的气 泡，准备注射。 （3）注射前先用碘酒棉花或酒精棉花消毒鱼体背部皮肤，注射者以预先 准备好的带针头（可用 4 号）的注射器（内装稀释后的菌液），刺入被消毒处 的肌肉，注射 0.2ml/尾的菌悬液。注射时要缓缓推动筒心，不能太快。然后拔 出注射器，再次用碘酒棉花或酒精棉花消毒鱼体被注射处。 （4）为了使实验数据更有说服力，还应用生理盐水注射相同数量（用菌 液注射的鱼体尾数）的鱼体，设为对照组，注射方法同上一步骤。 3. 观察 注射完后将鱼体放入水体，对其进行常规的管理（一般应进行 1～2 周）， 随时进行观察，看是否有病症出现，如有，记录病症，并与自然发病症状比较， 如果症状一致，说明注射菌具有致病性（在条件允许的情况下，应对其进行细 菌的重分离，以便进一步的研究）；否则，说明注射菌可能不具有致病性