3.蛋白生化与生物物理技术3蛋白生化与生物物理技术3.1蛋白质表达系统3.1.1E.coli蛋白表达系统3.1.2哺乳动物表达系统3.1.3昆虫表达系统3.1.4硒代蛋白表达3.2蛋白纯化技术3.2.1AKTA使用规则及使用实例3.2.2蛋白纯化柱子的介绍及清洁方法3.2.3透析袋的使用3.2.4浓缩管的使用3.2.5TEV蛋白酶的使用3.2.6金属螯合层析3.2.7分子筛3.2.8疏水作用层析3.2.9离子交换层析3.2.10ProteinA/G纯化抗体3.2.11谷胱甘肽转移酶（GST)亲和层析3.2.12Fab的蛋白表达3.2.13植物种子蛋白的提取方案3.2.14包涵体复性3.2.15SDS-PAGE凝胶电泳3.2.16GraphPadPrism软件的使用3.3筛选与蛋白互作的分子3.3.1酵母双杂交技术从文库中筛选与蛋白X结合的蛋白3.3.2噬菌体展示3.3.3配体指数富集的系统进化技术筛选核酸适配体3.4检测蛋白与互作分子的互作3.4.1酵母双杂交Yeasttwohybrid3.4.2双分子荧光互补Bimolecularfluorescencecomplementation3.4.3 Western Blotting3.4.4免疫共沉淀Co-lmmunoprecipitation3.4.5差示扫描荧光技术DifferentialScanningFluorimetry3.4.6荧光偏振Fluorescencepolarization3.4.7等温滴定微量热lsothermalTitrationCalorimetry
3. 蛋白生化与生物物理技术 3 蛋白生化与生物物理技术 3.1蛋白质表达系统 3.1.1 E. coli蛋白表达系统 3.1.2哺乳动物表达系统 3.1.3昆虫表达系统 3.1.4硒代蛋白表达 3.2蛋白纯化技术 3.2.1 AKTA使用规则及使用实例 3.2.2蛋白纯化柱子的介绍及清洁方法 3.2.3透析袋的使用 3.2.4浓缩管的使用 3.2.5 TEV蛋白酶的使用 3.2.6金属螯合层析 3.2.7分子筛 3.2.8疏水作用层析 3.2.9离子交换层析 3.2.10 Protein A/G 纯化抗体 3.2.11谷胱甘肽转移酶 (GST) 亲和层析 3.2.12 Fab的蛋白表达 3.2.13植物种子蛋白的提取方案 3.2.14包涵体复性 3.2.15 SDS-PAGE凝胶电泳 3.2.16 GraphPad Prism软件的使用 3.3筛选与蛋白互作的分子 3.3.1酵母双杂交技术从文库中筛选与蛋白X结合的蛋白 3.3.2噬菌体展示 3.3.3配体指数富集的系统进化技术筛选核酸适配体 3.4检测蛋白与互作分子的互作 3.4.1酵母双杂交 Yeast two hybrid 3.4.2双分子荧光互补Bimolecular fluorescence complementation 3.4.3 Western Blotting 3.4.4免疫共沉淀Co-Immunoprecipitation 3.4.5差示扫描荧光技术Differential Scanning Fluorimetry 3.4.6荧光偏振Fluorescence polarization 3.4.7等温滴定微量热Isothermal Titration Calorimetry
3.4.8表面等离子共振技术Biacore3.4.9蛋白质交联Crosslink3.4.10Native-PAGE3.4.11静态光散射Staticlightscattering3.4.12凝胶阻滞实验EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay3.5蛋白生化实验技术3.5.1蛋白酶活性检测3.5.2ATP酶活检测3.5.3解旋酶活性检测3.5.4体外转录实验3.1蛋白质表达系统3.1.1E.coli蛋白表达系统蛋白的原核表达是指用细菌（例如大肠杆菌）表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。原核表达的优点主要在宿主菌生长较快，易于操作，产量较高等。对于结构生物学这类需要大量蛋白质的学科来说比较适用。常用的大肠杆菌表达系统大多采用T7promoter，它可以结合Lacoperon和Araoperon的元件，对其控制的基因表达做调控。通常目的蛋白的表达可以通过添加诱导剂来实现，本实验室常用诱导剂为IPTG，但也有用四环素和阿拉伯糖诱导原核表达系统。本实验室常用的表达菌株有BL21（DE3），Rosetta，CodonPlusRIPL等。常用的表达载体有V29H，V28E，V30，V55等。不同载体运用的蛋白表达方法不同，所以应根据不同载体的特点选择合适的表达菌株和诱导剂。更多表达载体的信息详见载体部分。3.1.1.1E.coli蛋白表达检测简介（INTRODUCTION）原核小规模表达测试是大规模蛋白表达前的预实验，只有小规模测试中能够成功表达目的蛋白的克隆才能用于大规模的蛋白表达。此处以小规模蛋白表达检测为例（大规模蛋白表达类同小规模表达，不同的是前者所用培养基的用量以升为单位）。材料（MATERIALS）口试剂（REAGENTS）无抗性液体培养基（包含试管装5mL液体培养基）、含抗生素固体培养基、抗生素（视载体情况而定）、诱导剂（1MIPTG）、60%甘油（使用前需灭菌）、SDS-Loading、考马斯亮蓝。实验步骤（PROCEDURE）1.第一天：转化重组质粒至表达菌株，37℃C培养箱过夜培养16h。2.第二天：挑单克隆于5mL抗性培养基（一般一种菌株挑取2-5个单克隆），37C摇床培养至OD600=1.2（大约5小时）。1）保菌：在超净台台中取菌液和甘油相同体积于冻存管（使甘油终浓度在20%~30%之间，例如0.5mL菌液+0.5mL60%甘油），混匀后放入-80C冰箱中保存。2）对照：从试管中分别吸取1mL菌液至2mL离心管中，不加诱导剂，16C摇床中诱导约3小时。3）诱导：从试管中分别吸取1mL菌液至2mL离心管中，加入适量诱导剂（常为1μL1MIPTG，其他诱导剂用量请参见其使用说明书，16°C摇床中诱导约3小时。3.SDS-PAGE检测
3.4.8表面等离子共振技术Biacore 3.4.9蛋白质交联Crosslink 3.4.10 Native-PAGE 3.4.11静态光散射Static light scattering 3.4.12凝胶阻滞实验EMSA-electrophoretic mobility shift assay 3.5蛋白生化实验技术 3.5.1蛋白酶活性检测 3.5.2 ATP酶活检测 3.5.3解旋酶活性检测 3.5.4体外转录实验 3.1 蛋白质表达系统 3.1.1 E. coli蛋白表达系统 蛋白的原核表达是指用细菌（例如大肠杆菌）表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。原核表达的 优点主要在宿主菌生长较快，易于操作，产量较高等。对于结构生物学这类需要大量蛋白质的学科来说比 较适用。 常用的大肠杆菌表达系统大多采用T7 promoter，它可以结合Lac operon和Ara operon的元件，对其控制 的基因表达做调控。通常目的蛋白的表达可以通过添加诱导剂来实现，本实验室常用诱导剂为IPTG，但 也有用四环素和阿拉伯糖诱导原核表达系统。本实验室常用的表达菌株有BL21（DE3），Rosetta，Codon Plus RIPL等。常用的表达载体有V29H，V28E，V30，V55等。不同载体运用的蛋白表达方法不同，所以 应根据不同载体的特点选择合适的表达菌株和诱导剂。更多表达载体的信息详见载体部分。 3.1.1.1 E. coli蛋白表达检测 简介（INTRODUCTION） 原核小规模表达测试是大规模蛋白表达前的预实验，只有小规模测试中能够成功表达目的蛋白的克 隆才能用于大规模的蛋白表达。此处以小规模蛋白表达检测为例（大规模蛋白表达类同小规模表达，不同 的是前者所用培养基的用量以升为单位）。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） 无抗性液体培养基（包含试管装5 mL液体培养基）、含抗生素固体培养基、抗生素（视载体情况而 定）、诱导剂（1 M IPTG）、60%甘油（使用前需灭菌）、SDS-Loading、考马斯亮蓝。 实验步骤（PROCEDURE） 1. 第一天：转化重组质粒至表达菌株，37 °C培养箱过夜培养16 h。 2. 第二天：挑单克隆于5 mL抗性培养基（一般一种菌株挑取2-5个单克隆），37 °C摇床培养至OD600 =1.2 （大约5小时）。 1) 保菌：在超净台台中取菌液和甘油相同体积于冻存管（使甘油终浓度在20%~30%之间，例如0.5 mL菌液+0.5 mL 60%甘油），混匀后放入-80 °C冰箱中保存。 2) 对照：从试管中分别吸取1 mL菌液至2 mL离心管中，不加诱导剂，16 °C摇床中诱导约3小时。 3) 诱导：从试管中分别吸取1 mL菌液至2 mL离心管中，加入适量诱导剂（常为1 μL 1 M IPTG，其他 诱导剂用量请参见其使用说明书），16 °C摇床中诱导约3小时。 3. SDS-PAGE检测
1）诱导组和对照组的菌液，5000rpm离心5min，弃上清（此时可以打开煮样器，让其升温）。2）每管加入100μLddH2O重悬，并加入SDS-loading至1×，混匀，煮样器中煮10~20min。3）12000rpm离心10min（此时可以将蛋白电泳装置准备好）。4）将离心好的样品取上清按照未诱导、诱导、未诱的方式对应跑胶。5）对成功诱导的克隆进行-80C冰箱甘油保存。：2614蛋白表达诱导SDS-PAGE检测结果。UI：未诱导，I：诱导。针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.尽量不要在冰箱中冻存过多的表达/克隆菌，节约公共资源。2．实验室常用的抗生素有Kan和Amp，具体抗性视载体情况而定，例如V28E、V29H等载体抗KanV55、V137、V138等载体抗Amp；并不是所有载体都用IPTG诱导，使用前需要查看相关说明书。3.若重复若干次实验，目的蛋白的小规模表达均不理想，可以考虑更换载体或表达菌株再进行小规模诱导检测；4.若想确定蛋白表达是在包涵体中还是上清，可以从诱导成功的冻存菌中再接种表达菌进行诱导表达，诱导结束后离心菌液取沉淀，加入缓冲液后进行超声破碎，再次离心分别取上清液和沉淀制样，通过SDS-PAGE检测以确定表达的情况。5.对于一些特殊性质或较难表达的蛋白，可尝试不同的表达菌株，例如AI可用于表达毒性蛋白，Rosetta、RIP、RIPL常用于表达哺乳动物蛋白（含有稀有密码子）。3.1.1.2E.coli大规模蛋白表达简介（INTRODUCTION）蛋白质是行使用生物学功能的最重要的一类分子。利用生物化学、生物物理，特别是结构生物学等手段对蛋白质进行研究，需要大量的高纯度的蛋白。利用异源表达宿主来表达重组蛋白是目前最常用的一种方式。蛋白表达纯化系统有很多种，比较常用的有原核表达系统（大肠杆菌）和真核表达系统（如酵母、昆虫细胞或者哺乳动物细胞）。不同的表达系统各有优缺点，而不同的蛋白对表达系统的要求也不同。这里仅介绍大肠杆菌表达系统。材料（MATERIALS）口试剂（REAGENTS）LB培养基、抗生素（根据载体抗性而定）、1MIPTG、50%葡萄糖、2MMgSO4口实验前准备（SETUP）清洗2L的摇菌烧瓶；清洗若干个50mL离心管（灭菌后用于接菌）口器械（EQUIPMENT）摇床、超净台、高压灭菌锅实验步骤（PROCEDURE）
1) 诱导组和对照组的菌液，5000 rpm离心5 min，弃上清（此时可以打开煮样器，让其升温）。 2) 每管加入100 μL ddH2O重悬，并加入SDS-loading至1×，混匀，煮样器中煮10~20 min。 3) 12000 rpm离心10 min（此时可以将蛋白电泳装置准备好）。 4) 将离心好的样品取上清按照未诱导、诱导、未诱的方式对应跑胶。 5) 对成功诱导的克隆进行-80 °C冰箱甘油保存。 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 尽量不要在冰箱中冻存过多的表达/克隆菌，节约公共资源。 2. 实验室常用的抗生素有Kan和Amp，具体抗性视载体情况而定，例如V28E、V29H等载体抗Kan， V55、V137、V138等载体抗Amp；并不是所有载体都用IPTG诱导，使用前需要查看相关说明书。 3. 若重复若干次实验，目的蛋白的小规模表达均不理想，可以考虑更换载体或表达菌株再进行小规模诱 导检测； 4. 若想确定蛋白表达是在包涵体中还是上清，可以从诱导成功的冻存菌中再接种表达菌进行诱导表达， 诱导结束后离心菌液取沉淀，加入缓冲液后进行超声破碎，再次离心分别取上清液和沉淀制样，通过 SDS-PAGE检测以确定表达的情况。 5. 对于一些特殊性质或较难表达的蛋白，可尝试不同的表达菌株，例如AI可用于表达毒性蛋白， Rosetta、RIP、RIPL常用于表达哺乳动物蛋白（含有稀有密码子）。 3.1.1.2 E. coli大规模蛋白表达 简介（INTRODUCTION） 蛋白质是行使用生物学功能的最重要的一类分子。利用生物化学、生物物理，特别是结构生物学等手 段对蛋白质进行研究，需要大量的高纯度的蛋白。利用异源表达宿主来表达重组蛋白是目前最常用的一种 方式。 蛋白表达纯化系统有很多种，比较常用的有原核表达系统（大肠杆菌）和真核表达系统（如酵母、昆 虫细胞或者哺乳动物细胞）。不同的表达系统各有优缺点，而不同的蛋白对表达系统的要求也不同。这里 仅介绍大肠杆菌表达系统。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） LB培养基、抗生素（根据载体抗性而定）、1 M IPTG、50%葡萄糖、2 M MgSO4 r 实验前准备（SETUP） 清洗2 L的摇菌烧瓶；清洗若干个50 mL离心管（灭菌后用于接菌） r 器械（EQUIPMENT） 摇床、超净台、高压灭菌锅 实验步骤（PROCEDURE）
1.配制LB：在大规模摇菌前一天配制LB，以5升LB培养基为例：称取50gNaCl、50g蛋白陈、25g酵母粉溶于自来水定容至5L。同时配制用于第二天大规模接菌的LB培养基：称取2.5gLURIABROTH（MillersLBBroth）溶于100mL纯水的烧瓶中。将上述LB培养基、50mL干净离心管、50%葡萄糖、2MMgSO4于高压灭菌锅121°C灭菌20min。2.在超净工作台中将小规模诱导成功的表达菌接种于100mLLB培养基中，并加入相应的抗生素，同时也可每升可添加1ml2MMgSO4和5ml50%无菌葡萄糖（促进细胞生长，抑制基础/漏表达），37C摇床内过夜摇菌。3.UV灭菌：在第二天大规模摇菌前打开大摇床的UV照射灭菌，同时将LB、灭菌后离心管、抗生素及所需枪头喷洒酒精后放入超净台内，打开UV照射灭菌20min。4.接菌：用无菌50mL离心管将过夜培养的菌液平分至5升LB中，并加入相应抗生素。5.摇菌：37C摇床内大规模摇菌至OD600值为1.2（约需3~4小时），然后调节温度至16，加IPTG诱导表达4h后于4℃落地离心机收菌，-80C冷藏。针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.尽量不要使用甘油冻存菌直接接菌，建议重新划线LB平板然后挑取单克隆，以避免噬菌体污染和质粒丢失；2.根据蛋白表达量确定大规模摇菌体积，如果表达量很高的蛋白一般3L足够，而表达量低的蛋白可多摇至10或12L，一般情况下，我们需要纯化得到几毫克的蛋白用于结晶及后续相关实验用。3.由于大摇床降温速度较慢，提前开始降温至16C，冷却1h后再加入IPTG；诱导时间一般4小时足够，具体诱导时间长短，以获得最终有活性非聚合蛋白的量为准，诱导时间过长可能包涵体或聚合体产量大，也有可能发生蛋白降解。4.收菌前吸取30OμL菌液制备SDS-PAGE样品，纯化之前先鉴定蛋白表达与否。5.诱导的条件，比如时间和温度，可以根据需要进一步优化。3.1.1.3蛋白纯化简介（INTRODUCTION）蛋白质通过原核或者真核表达系统表达后是一种既有宿主蛋白也有目的蛋白的混合体，我们需要通过目的蛋白的特点去进行特异的筛选，把目的蛋白从混合体中分离出来。目前用的较多的一种方法就是金属离子亲和层析（也叫IMAC）的方法。在设计克隆时人为地在目的蛋白的N端或者C端加入6个或者更多连续的组氨酸，组氨酸可以与Ni2+，Cu2+，Co2+结合，再用高浓度的咪唑将目的蛋白洗脱下来。因此目前市场上常见的IMAC柱有三种：Ni柱，Cu柱以及Co柱。用于螯合这些金属离子的螯合剂有NTA（nitrilotriaceticacid，次氮基三乙酸）和IDA（iminodiaceticacid，亚氨基二乙酸）。所以我们实验室常用的Ni-NTA就是用NTA作为整合剂的Ni2+离子亲和柱。三种金属离子柱比较：结合强度特异性★Co2+柱★★★Ni2+柱★★★★Cu2+柱★★★★Co2+柱的结合能力最弱，因此其特异性最好，但损失也是最大的；Cu2+柱的结合能力最强，特异性是最差的，但是产量高，因此对于那些蛋白产量低的情况可以用于初筛；Ni2+柱介于中间。下面以Ni2+柱为例，介绍IMAC流程。材料（MATERIALS）口试剂（REAGENTS）Ni-Bindingbuffer:0.50MNaCl,16mMImidazole,20mMTris-HClpH8.0Elutionbuffer:0.50MNaCl,400mMImidazole，20mMTris-HClpH8.0Gelfiltrationbuffer:0.25MNaCl,10mMTris-HCIpH8.0口实验前准备（SETUP）
1. 配制LB：在大规模摇菌前一天配制LB，以5升LB培养基为例：称取50 g NaCl、50 g 蛋白胨、25 g 酵 母粉溶于自来水定容至5 L。同时配制用于第二天大规模接菌的LB培养基：称取2.5 g LURIA BROTH （Miller’s LB Broth）溶于100 mL纯水的烧瓶中。将上述LB培养基、50 mL干净离心管、50%葡萄糖、2 M MgSO4于高压灭菌锅121 °C灭菌20 min。 2. 在超净工作台中将小规模诱导成功的表达菌接种于100 mL LB培养基中，并加入相应的抗生素，同时也 可每升可添加1 ml 2M MgSO4和5 ml 50%无菌葡萄糖（促进细胞生长，抑制基础/漏表达），37 °C摇床内 过夜摇菌。 3. UV灭菌：在第二天大规模摇菌前打开大摇床的UV照射灭菌，同时将LB、灭菌后离心管、抗生素及所 需枪头喷洒酒精后放入超净台内，打开UV照射灭菌20 min。 4. 接菌：用无菌50 mL离心管将过夜培养的菌液平分至5升LB中，并加入相应抗生素。 5. 摇菌：37 °C摇床内大规模摇菌至OD600值为1.2（约需3~4小时），然后调节温度至16 °C，加IPTG诱 导表达4 h后于4 °C落地离心机收菌，-80 °C冷藏。 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 尽量不要使用甘油冻存菌直接接菌，建议重新划线LB平板然后挑取单克隆，以避免噬菌体污染和质粒 丢失； 2. 根据蛋白表达量确定大规模摇菌体积，如果表达量很高的蛋白一般3 L足够，而表达量低的蛋白可多摇 至10或12 L，一般情况下，我们需要纯化得到几毫克的蛋白用于结晶及后续相关实验用。 3. 由于大摇床降温速度较慢，提前开始降温至16 °C，冷却1 h后再加入IPTG；诱导时间一般4小时足够， 具体诱导时间长短，以获得最终有活性非聚合蛋白的量为准，诱导时间过长可能包涵体或聚合体产量大， 也有可能发生蛋白降解。 4. 收菌前吸取300 μL菌液制备SDS-PAGE样品，纯化之前先鉴定蛋白表达与否。 5. 诱导的条件，比如时间和温度，可以根据需要进一步优化。 3.1.1.3蛋白纯化 简介（INTRODUCTION） 蛋白质通过原核或者真核表达系统表达后是一种既有宿主蛋白也有目的蛋白的混合体，我们需要通过 目的蛋白的特点去进行特异的筛选，把目的蛋白从混合体中分离出来。目前用的较多的一种方法就是金属 离子亲和层析（也叫IMAC）的方法。在设计克隆时人为地在目的蛋白的N端或者C端加入6个或者更多连 续的组氨酸，组氨酸可以与Ni2+，Cu2+，Co2+结合，再用高浓度的咪唑将目的蛋白洗脱下来。 因此目前市场上常见的IMAC柱有三种：Ni柱，Cu柱以及Co柱。用于螯合这些金属离子的螯合剂有 NTA（nitrilotriacetic acid，次氮基三乙酸）和IDA（iminodiacetic acid，亚氨基二乙酸）。所以我们实验室 常用的Ni-NTA就是用NTA作为螯合剂的Ni2+离子亲和柱。 三种金属离子柱比较： 结合强度 特异性 Co2+柱 ★ ★★★ Ni2+柱 ★★ ★★ Cu2+柱 ★★★ ★ Co2+柱的结合能力最弱，因此其特异性最好，但损失也是最大的；Cu2+柱的结合能力最强，特异性 是最差的，但是产量高，因此对于那些蛋白产量低的情况可以用于初筛；Ni2+柱介于中间。 下面以Ni2+柱为例，介绍IMAC流程。 材料（MATERIALS） r 试剂（REAGENTS） Ni-Binding buffer：0.50 M NaCl，16 mM Imidazole，20 mM Tris-HCl pH 8.0 Elution buffer：0.50 M NaCl，400 mM Imidazole，20 mM Tris-HCl pH 8.0 Gel filtration buffer：0.25 M NaCl，10 mM Tris-HCl pH 8.0 r 实验前准备（SETUP）
buffer使用前在放在4C冰箱预冷，准备收集管，保证有足够的干净且已烘干的玻璃管口器械（EQUIPMENT）Thermo落地式离心机（使用前预冷至4°C），AKTAFPLC纯化仪，超声仪，抽滤泵实验步骤（PROCEDURE）以MBP融合表达蛋白为例：A.纯化蛋白——一次Ni亲和柱（详见3.2.6金属螯合层析章节）、破菌预计消耗时间：30min~1h1.将冻存在-80C冰箱的菌拿出来，放在水里解冻，根据细菌湿重每克5~10mL加入Ni-Bindingbuffer。解冻后把金属烧杯放在冰上，进行超声。对于不稳定的蛋白，可加入PMSF以防止蛋白降解。2.将烧杯至于冰水中进行超声破碎。液流不呈丝状时，说明已超声完全。3.用完后用水洗探头。关键步骤：口观察蛋白质纯化过程中蛋白质的降解和沉淀情况，当蛋白易降解时，可在所有缓冲液及蛋白收集。液中加入通用丝氨酸蛋白酶抑制剂（PMSF，终浓度0.5mM）抑制蛋白降解。离心、过滤预计消耗时间：40min1.将超声好的菌液平均倒入离心管中，配平好，放入已预冷至4C的落地式离心机。2.14000rpm离心20分钟，将上清倒入小烧杯中。3.组装好抽滤装置进行抽滤（注意不要漏，样品和滤瓶均要放在冰上）。、平衡Ni-NTA柱预计消耗时间：20min1.将N柱从4C冰箱取出，这时柱里面是20%酒精。2.限压0.4Mpa，流速3mL/min，水洗Ni柱10分钟。3.换成Ni-Bindingbuffer再洗10分钟，将Ni柱平衡好。上样使蛋白挂柱预计消耗时间：根据样品体积而定1．将Superloop和Ni柱都放在冰上，用洗好的绿色的连接管湿接Ni柱。2.蠕动泵流速设定为3mL/min，限压为0.4MPa。3.当样品流完一个柱体积时，用Ep管接流出的样品，标记好“firstflowthrough”。4.当样品快流完时，用Ep管接流出的样品，标记好“lastflowthrough”，用于后续检测。关键步骤：口样品体积小时可以减速，使样品充分与Ni2+进行反应，能挂柱的都挂上口第一次纯化某蛋白时，建议收集流出液，避免蛋白不挂柱损失蛋白（注意避免气泡进入柱子）洗脱目的蛋白预计消耗时间：40min1.提前将AKTA的A，B泵用水进行systemwash。再用buffer，即A泵用Ni-Bindingbuffer，B泵用Elutionbuffer进行systemwash。2.将系统流速设置1mL/min，manualrun时把Ni柱湿接到AKTA纯化仪上。3.调程序（以AKTAPrime为例）：设置3mL/min，0.4MPa，Load。check point (mL)%BFraction(mL)004%5304%80560%59060%4.程序跑完后，将结果保存至自已的文件夹中，写明日期、样品名、程序类型（Ni柱洗脱还是分子筛等）。5.在图谱中与目的蛋白的峰对应的样品收集到一个干净的50mL离心管，取40μL至Ep管中，标记好“Nielution”，与前面的样品以及跑蛋白电泳，检测纯化效果。6.AKTA的A，B泵用水进行systemwash
buffer使用前在放在4 °C冰箱预冷，准备收集管，保证有足够的干净且已烘干的玻璃管 r 器械（EQUIPMENT） Thermo落地式离心机（使用前预冷至4 °C），AKTA FPLC纯化仪，超声仪，抽滤泵 实验步骤（PROCEDURE） 以MBP融合表达蛋白为例： A. 纯化蛋白——一次Ni亲和柱 （详见3.2.6金属螯合层析章节） ► 破菌 ►预计消耗时间：30 min~1 h 1. 将冻存在-80 °C冰箱的菌拿出来，放在水里解冻，根据细菌湿重每克5~10 mL加入Ni-Binding buffer。 解冻后把金属烧杯放在冰上，进行超声。对于不稳定的蛋白，可加入PMSF以防止蛋白降解。 2. 将烧杯至于冰水中进行超声破碎。液流不呈丝状时，说明已超声完全。 3. 用完后用水洗探头。 ▲ 关键步骤： ♫ 观察蛋白质纯化过程中蛋白质的降解和沉淀情况，当蛋白易降解时，可在所有缓冲液及蛋白收集。液 中加入通用丝氨酸蛋白酶抑制剂（PMSF，终浓度0.5 mM）抑制蛋白降解。 ► 离心、过滤 ►预计消耗时间：40 min 1. 将超声好的菌液平均倒入离心管中，配平好，放入已预冷至4 °C的落地式离心机。 2. 14000 rpm 离心20分钟，将上清倒入小烧杯中。 3. 组装好抽滤装置进行抽滤（注意不要漏，样品和滤瓶均要放在冰上）。 ► 平衡Ni-NTA柱 ►预计消耗时间：20 min 1. 将Ni柱从4 °C冰箱取出，这时柱里面是20%酒精。 2. 限压0.4 Mpa，流速3 mL/min，水洗Ni柱10分钟。 3. 换成Ni-Binding buffer再洗10分钟，将Ni柱平衡好。 ► 上样使蛋白挂柱 ►预计消耗时间：根据样品体积而定 1. 将Super loop和Ni柱都放在冰上，用洗好的绿色的连接管湿接Ni柱。 2. 蠕动泵流速设定为3 mL/min，限压为0.4 MPa。 3. 当样品流完一个柱体积时，用Ep管接流出的样品，标记好“first flow through”。 4. 当样品快流完时，用Ep管接流出的样品，标记好“last flow through”，用于后续检测。 ▲关键步骤： ♫ 样品体积小时可以减速，使样品充分与Ni2+进行反应，能挂柱的都挂上 ♫ 第一次纯化某蛋白时，建议收集流出液，避免蛋白不挂柱损失蛋白（注意避免气泡进入柱子） ► 洗脱目的蛋白 ►预计消耗时间：40 min 1. 提前将AKTA的A，B泵用水进行system wash。再用buffer，即A泵用Ni-Binding buffer，B泵用Elution buffer进行system wash。 2. 将系统流速设置1 mL/min，manual run时把Ni柱湿接到AKTA纯化仪上。 3. 调程序（以AKTA Prime为例）：设置3 mL/min，0.4 MPa，Load。 check point（mL） %B Fraction（mL） 0 4% 0 30 4% 5 80 60% 5 90 60% 5 4. 程序跑完后，将结果保存至自己的文件夹中，写明日期、样品名、程序类型（Ni柱洗脱还是分子筛 等）。 5. 在图谱中与目的蛋白的峰对应的样品收集到一个干净的50 mL离心管，取40 μL至Ep管中，标记好“Ni elution”，与前面的样品以及跑蛋白电泳，检测纯化效果。 6. AKTA的A，B泵用水进行system wash