5.结构生物学实验技术5结构生物学实验技术5.1圆二色谱5.2小角散射5.3负染5.4冷冻电镜样品制备5.5蛋白结晶实验5.5.1结晶筛选5.5.2结晶条件优化5.5.3晶体冻存5.6晶体衍射及数据收集5.7单晶衍射数据收集要点5.8XDS预处理衍射数据5.9XDS-JVersionTheta5.10分子置换法解相位5.11结构优化检查清单5.12如何修正低分辨率的结构(5-6A）5.13结构解析软件的使用5.13.1HKL2000基本操作5.13.2CCP4基本操作5.13.3Phenix基本操作5.13.4Phenix.refine常见问题和解答5.13.5Pymol基本操作5.13.6用Pymol创建动画5.13.7用pymol和APBS画静电表面5.13.8用Autodock做分子对接5.14使用PISA进行生物大分子结构互作界面分析5.15Linux系统管理和常用命令5.1圆二色谱简介（INTRODUCTION）圆二色光谱（简称CD）是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。而且测定方法快速简便，对构象变化灵敏。样品对左、右圆偏振光（及正常的光）吸收程度不同，产生随圆偏振光。在理解圆偏振光之前，首先要介绍自然光、平面偏振光、椭圆偏振光等概念，自然光：光的一个固有特征是其振动平面与传播方向垂直，在自然光中，虽然每一束光的振动平面都与传播方向垂直，但不同束光之间的振动平面却无关联，可视为平均分配于垂直于传播方向的整个平面内，且平均来说，任一方向上具有相同的振幅，这种横振动对称于传播方向的光称为自然光既可将自然光看做圆柱形的光(下图）
5. 结构生物学实验技术 5 结构生物学实验技术 5.1圆二色谱 5.2小角散射 5.3负染 5.4冷冻电镜样品制备 5.5蛋白结晶实验 5.5.1结晶筛选 5.5.2结晶条件优化 5.5.3晶体冻存 5.6晶体衍射及数据收集 5.7单晶衍射数据收集要点 5.8 XDS预处理衍射数据 5.9 XDS-J Version Theta 5.10分子置换法解相位 5.11结构优化检查清单 5.12如何修正低分辨率的结构(5-6 Å) 5.13结构解析软件的使用 5.13.1 HKL2000 基本操作 5.13.2 CCP4基本操作 5.13.3 Phenix基本操作 5.13.4 Phenix.refine 常见问题和解答 5.13.5 Pymol 基本操作 5.13.6用Pymol创建动画 5.13.7用pymol和APBS画静电表面 5.13.8用Autodock做分子对接 5.14使用PISA进行生物大分子结构互作界面分析 5.15 Linux系统管理和常用命令 5.1 圆二色谱 简介（INTRODUCTION） 圆二色光谱（简称CD）是应用最为广泛的测定蛋白质二级结构的方法，是研究稀溶液中蛋白质构象的一种 快速、简单、较准确的方法。它可以在溶液状态下测定，较接近其生理状态。而且测定方法快速简便，对构象 变化灵敏。样品对左、右圆偏振光（及正常的光）吸收程度不同，产生椭圆偏振光。在理解圆偏振光之前，首 先要介绍自然光、平面偏振光、椭圆偏振光等概念。 自然光：光的一个固有特征是其振动平面与传播方向垂直，在自然光中，虽然每一束光的振动平面都与传 播方向垂直，但不同束光之间的振动平面却无关联，可视为平均分配于垂直于传播方向的整个平面内，且平均 来说，任一方向上具有相同的振幅，这种横振动对称于传播方向的光称为自然光既可将自然光看做圆柱形的光 （下图）
AA人传播方向振动方尚平面偏振光：如果在光的传播方向上光的振动平面在确定的平面内，这种光被称为平面偏振光或线偏振光。圆偏振光：如果光的振动平面随时间作有规则地改变，即振动平面轨迹在垂直于传播方向的平面上呈圆形或椭圆形，则称圆偏振光或椭圆偏振光可视为像弹簧一样的光，根据方向又可分左、右旋圆偏振光。因为光遵循失量合成所以圆偏振光可视为传播方向相同，振动方向相互垂直且相位差恒定为1/2的两平面偏振光叠加后可合成光失量有规则变化的圆偏振光。圆偏振光的电失量大小保持不变，而方向随时间变化，即螺旋前进。红绿为两束相互垂直，但相位差1/2的两条平面偏振光，蓝色虚线为合成的圆偏振光表格：不同光失量合成效果类型相位频率振幅合成效果相同相同差1/2圆偏振光平面偏振光相同相同相同左右圆偏振光平面偏振光左右圆偏振光相同相同不同平面偏振光相同不同左右圆偏振光椭圆偏振光圆二色性基本原理：蛋白质或多肽中的光活性基团有肽键、芳香基团、二硫键。当平面偏振光通过这些基团时，其对左右圆偏振光的吸收不相同，造成左右圆偏振光的振幅不同，合成的圆偏振光变为椭圆偏振光。这就是蛋白质的圆二色性。在蛋白质分子中，肽链的不同部分可分别形成α-螺旋、β-折叠、β-转角等特定的立体结构。这些立体结构都是不对称的。蛋白质的肽键在紫外185~240纳米处有光吸收，因此它在这一波长范围内有圆二色性。几种不同的蛋白质立体结构所表现的椭圆值波长的变化曲线一圆二色谱是不同的。如下图所示，α螺旋的谱是双负峰形的，β-折叠是单负峰形的，无规卷曲在波长很短的地方出单峰。蛋白质的圆二色谱是它们所含各种立体结构组分的圆二色谱的代数加和曲线。因此用这一波长范围的圆二色谱可研究蛋白质中各种立体结构的含量
平面偏振光：如果在光的传播方向上光的振动平面在确定的平面 内，这种光被称为平面偏振光或线偏振光。 圆偏振光：如果光的振动平面随时间作有规则地改 变，即振动平面轨迹在垂直于传播方向的平面上呈圆形或 椭圆形,则称圆偏振光或椭圆偏振光可视为像弹簧一样的 光，根据方向又可分左、右旋圆偏振光。因为光遵循矢量 合成所以圆偏振光可视为传播方向相同，振动方向相互垂 直且相位差恒定为1/2的两平面偏振光叠加后可合成光矢 量有规则变化的圆偏振光。圆偏振光的电矢量大小保持不变，而方向随时间变化，即螺旋前进。 红绿为两束相互垂直，但相位差1/2的两条平面偏振光，蓝色虚线为合成的圆偏振光。 表格：不同光矢量合成效果 类型 频率 振幅 相位 合成效果 平面偏振光 相同 相同 差1/2 圆偏振光 左右圆偏振光 相同 相同 相同 平面偏振光 左右圆偏振光 相同 相同 不同 平面偏振光 左右圆偏振光 相同 不同 椭圆偏振光 圆二色性基本原理：蛋白质或多肽中的光活性基团有肽键、芳香基团、二硫键。当平面偏振光通过这些基 团时，其对左右圆偏振光的吸收不相同，造成左右圆偏振光的振幅不同，合成的圆偏振光变为椭圆偏振光。这 就是蛋白质的圆二色性。在蛋白质分子中，肽链的不同部分可分别形成α-螺旋、β-折叠、β-转角等特定的立体结 构。这些立体结构都是不对称的。蛋白质的肽键在紫外185~240纳米处有光吸收，因此它在这一波长范围内有 圆二色性。几种不同的蛋白质立体结构所表现的椭圆值波长的变化曲线──圆二色谱是不同的。如下图所示，α- 螺旋的谱是双负峰形的，β-折叠是单负峰形的，无规卷曲在波长很短的地方出单峰。蛋白质的圆二色谱是它们 所含各种立体结构组分的圆二色谱的代数加和曲线。因此用这一波长范围的圆二色谱可研究蛋白质中各种立体 结构的含量
401a-helix30anti-parallel β-sheetparallel β-sheetpoly (L-proline) type ll helibandomcoi10(-/ow)-P-10-20180220200240Wavelength (nm)利用圆二色谱验证蛋白质稳定性通常实验中需要验证蛋白质与小分子结合或者蛋白质本身的稳定性，利用圆二色谱测定蛋白质（与小分子结合）的变温曲线，我们可以通过计算其Tm值确定其稳定性。材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）石英杯清洗剂（仪器中心提供）缓冲液(BUFFER)磷酸盐缓冲液，150mMNaC器械（EQUIPMENT）ChirascanSpectrometer（AppliedPhotophysics，Leatherhead，UK)、1mm厚度的石英比色皿实验步骤(PROCEDURE)1.准备蛋白样品，浓度为0.3~0.5mg/mL，蛋白所在缓冲液为磷酸盐缓冲液；2.圆二色谱仪开机后需要充氮气约30min，再打开疝气灯。设置扫描波长范围：180nm~260nm，重复2次。3.先检测仪器稳定性，直接扫描空气，得到一个范围在0.1附近的直线为正常，在检测蛋白圆二色谱曲线前分别检测对应的缓冲液曲线（应该是一条直线）4.检测样品二级结构折叠情况：吸取200μL蛋白样品至规格为1mm厚度的比色Ⅲ中，透光观察避免气泡温度为20℃C，扫描后可得到曲线；5.检测蛋白质热变性：需要开启冷循环控制器。吸取200μL蛋白样品至规格为1mm厚度的比色血中，透光观察避免气泡，将温度探测针插入样品中，温度范围是20℃C~95℃，每隔5℃检测一次，每次检测重复2次。根据蛋白初始二级结构光谱曲线取220nm或者222nm处的数据用GraphPadPrism5.0做图，拟合并计算Tm。附：数据处理与结果验证MobiluncuscurtisiiCAMP-NTD的二级结构及其热稳定性1.NTD的圆二色谱：经如上实验步骤获得实验数据，导入Prism中作曲线图，得如下结果，为规则的α-螺旋：
利用圆二色谱验证蛋白质稳定性 通常实验中需要验证蛋白质与小分子结合或者蛋白质本身的稳定性，利用圆二色谱测定蛋白质（与小分子 结合）的变温曲线，我们可以通过计算其Tm值确定其稳定性。 材料（MATERIALS） 试剂（REAGENTS） 石英杯清洗剂（仪器中心提供） 缓冲液（BUFFER） 磷酸盐缓冲液，150 mM NaCl 器械（EQUIPMENT） Chirascan Spectrometer (Applied Photophysics，Leatherhead，UK)、1 mm厚度的石英比色皿 实验步骤（PROCEDURE） 1. 准备蛋白样品，浓度为0.3~0.5 mg/mL，蛋白所在缓冲液为磷酸盐缓冲液； 2. 圆二色谱仪开机后需要充氮气约30 min，再打开疝气灯。设置扫描波长范围：180 nm~260 nm，重复2 次。 3. 先检测仪器稳定性，直接扫描空气，得到一个范围在0.1附近的直线为正常，在检测蛋白圆二色谱曲线前 分别检测对应的缓冲液曲线（应该是一条直线）； 4. 检测样品二级结构折叠情况：吸取200 μL蛋白样品至规格为1 mm厚度的比色皿中，透光观察避免气泡， 温度为20 °C，扫描后可得到曲线； 5. 检测蛋白质热变性：需要开启冷循环控制器。吸取200 μL蛋白样品至规格为1 mm厚度的比色皿中，透光 观察避免气泡，将温度探测针插入样品中，温度范围是20 °C~95 °C，每隔5 °C检测一次，每次检测重复2次。 根据蛋白初始二级结构光谱曲线取220 nm或者222 nm处的数据用GraphPad Prism 5.0做图，拟合并计算Tm。 附：数据处理与结果 验证Mobiluncus curtisii CAMP-NTD的二级结构及其热稳定性。 1. NTD的圆二色谱：经如上实验步骤获得实验数据，导入Prism中作曲线图，得如下结果，为规则的α-螺 旋：
CAMP-NTD(bapu) ao2040200220240260Wavelength (nm)2.NTD的热变性曲线：选取EXCEL数据表中222nm处的数值（为不同温度在222nm扫描得到的数值）导入Prism中作曲线图，得到如下结果：()0-1020.30?0-40--50-20406080100Temperature (C)3.Tm值的计算：50DLHG202元XOUH4ne.AnslyeAnalyzeParameters:NonlirDweigheaidvieslRargeOuouDiogeneNTDToedadreN.TamteHmdSigmoidal dose-responseNonlinearregression (curve fit)(variable slope)口lonlinfi推aSSigmoidal dose-response (variable slope)Bestitvalues42.63Bottor22.93lonlinfitofNTDTmTmLogEC5052.820.1622SiopEC50Std.Eror0.6026Bottor100.4615T11LogECSO0.635412O.032294.Fit后的结果，如下图：
2. NTD的热变性曲线：选取EXCEL数据表中222 nm处的数值（为不同温度在222 nm扫描得到的数值）导 入Prism中作曲线图，得到如下结果： 3. Tm值的计算： 4. Fit后的结果，如下图：
SMC CAMP-NTTm=52.82±0.46C-10230-@408-50-540608010020Temperature (C)针对性建议（TROUBLESHOOTING）样品要求：1.样品必须保持一定的纯度不含光吸收的杂质，溶剂必须在测定波长没有吸收干扰；样品能完全溶解在溶剂中，形成均一透明的溶液；2.氮气流量的控制，实验中途要时刻关注氮气是否充足，如不充足需及时更换氮气瓶3.缓冲液、溶剂要求与池子选择：缓冲液和溶剂在配制溶液前要做单独的检查，看是否在测定波长范围内有吸收干扰，看是否形成沉淀和胶状；在蛋白质测量中，经常选择透明性极好的磷酸盐作为缓冲体系；4.样品浓度一般在0.05~0.5mg/mL，浓度太高噪音太大会影响结果，5.样品不同，测定的圆二色光谱范围不同，对池子大小（光径）的选择和浓度的要求也不一样；蛋白质CD光谱测量一般在相对较稀的溶液中进行6.保持石英杯干净透亮，通常完成蛋白热变性检测后石英杯内部会有蛋白质粘物，需要用清洗剂浸泡30分钟，再用清水冲洗干净；7.用去垢剂洗完石英杯后，需要用70%酒精进一步清洗。5.2小角散射简介（INTRODUCTION）X光散射技术是常用的非破坏性分析技术，可用于揭示物质的结构、化学组成以及物理性质。这些技术是以观测×射线穿过样品后的散射强度为基础，根据散射角度、极化度和入射光波长对实验结果进行分析。散射包括弹性散射和非弹性散射，弹性散射包括小角X射线散射（SAXS）、广角X射线散射（WAXS）；非弹性散射包括康普顿散射、共振非弹性X射线散射及X射线拉曼散射。SAXS主要测量散射角20接近0°时的经过样品后的X射线散射强度，而WAXS是测量散射角20大于5°在原理上散射振幅等于电子密度的傅立叶变换乘以一个角度相关的因子。假设样品有很多一样的颗粒组成，每个颗粒里面的电子密度以p(r)表示，最大的维度为Dmax，那么总的散射强度可以写成球坐标形式：，其中y(r)是密度的自相关函数的球形平均值（同一个长度，不同方向的平均）。(s)的极限即为Guinier公式，也就是In[1(s)]vss2，这个极限公式在s<的范围内适用，Rg为回旋半径SAXS的优点：对样品的要求很低，溶液样品即可，对分子量和浓度没有要求。由于SAXS在溶液中进行因此更好地反应生物大分子的真实状态，对原位研究动态过程提供了可能性。SAXS的缺点：得到的信息量很少，要得到三维结构的信息很困难，只能得到一些比较粗略且低分辨率的信息，如生物大分子的大小、形状、某些关键的片段、各个组分之间的空间关系等。对于SAXS来说，分子越大实验越容易，这一点和晶体学正好相反SAXS数据分析先用RAW软件：（可以从http://www.macchess.cornell.edu/MacCHESS/RAW_install.html免费下载软件并根据说明进行安装）来进行datareduction之后，一般用ATSAS软件包，里面包括很多小软件，根据不同的需要选择合适的软件。求解大体形状时可以用gnom、damin、gasbor等软件；如果是重建柔性区域可以用credo、corel、crysol等软件；如果是复合物结构重建则需要用massha、sasref、crysol等软件
针对性建议（TROUBLESHOOTING） 样品要求： 1. 样品必须保持一定的纯度不含光吸收的杂质，溶剂必须在测定波长没有吸收干扰；样品能完全溶解在溶 剂中, 形成均一透明的溶液； 2. 氮气流量的控制，实验中途要时刻关注氮气是否充足，如不充足需及时更换氮气瓶； 3. 缓冲液、溶剂要求与池子选择：缓冲液和溶剂在配制溶液前要做单独的检查，看是否在测定波长范围内 有吸收干扰，看是否形成沉淀和胶状；在蛋白质测量中，经常选择透明性极好的磷酸盐作为缓冲体系； 4. 样品浓度一般在0.05~0.5 mg/mL，浓度太高噪音太大会影响结果； 5. 样品不同，测定的圆二色光谱范围不同，对池子大小（光径）的选择和浓度的要求也不一样；蛋白质CD 光谱测量一般在相对较稀的溶液中进行； 6. 保持石英杯干净透亮，通常完成蛋白热变性检测后石英杯内部会有蛋白质粘物，需要用清洗剂浸泡30分 钟，再用清水冲洗干净； 7. 用去垢剂洗完石英杯后，需要用70% 酒精进一步清洗。 5.2 小角散射 简介（INTRODUCTION） X光散射技术是常用的非破坏性分析技术，可用于揭示物质的结构、化学组成以及物理性质。这些技术是 以观测X射线穿过样品后的散射强度为基础，根据散射角度、极化度和入射X光波长对实验结果进行分析。 散射包括弹性散射和非弹性散射，弹性散射包括小角X射线散射（SAXS）、广角X射线散射（WAXS）； 非弹性散射包括康普顿散射、共振非弹性X射线散射及X射线拉曼散射。SAXS主要测量散射角2θ接近0° 时的经 过样品后的X射线散射强度，而WAXS是测量散射角2θ大于5°。 在原理上散射振幅等于电子密度的傅立叶变换乘以一个角度相关的因子。假设样品有很多一样的颗粒组 成，每个颗粒里面的电子密度以ρ(r)表示，最大的维度为Dmax，那么总的散射强度可以写成球坐标形式：，其 中γ(r)是密度的自相关函数的球形平均值（同一个长度，不同方向的平均）。I(s)的极限即为Guinier公式，也就 是ln[I(s)] vs s2，这个极限公式在s<的范围内适用，Rg为回旋半径。 SAXS的优点：对样品的要求很低，溶液样品即可，对分子量和浓度没有要求。由于SAXS在溶液中进行， 因此更好地反应生物大分子的真实状态，对原位研究动态过程提供了可能性。 SAXS的缺点：得到的信息量很少，要得到三维结构的信息很困难，只能得到一些比较粗略且低分辨率的 信息，如生物大分子的大小、形状、某些关键的片段、各个组分之间的空间关系等。对于SAXS来说，分子越大 实验越容易，这一点和晶体学正好相反。 SAXS数据分析先用RAW软件: （可以从http://www.macchess.cornell.edu/MacCHESS/RAW_install.html免费下载软件并根据说明进行安 装）来进行data reduction之后，一般用ATSAS软件包，里面包括很多小软件，根据不同的需要选择合适的软 件。求解大体形状时可以用gnom、damin、gasbor等软件；如果是重建柔性区域可以用credo、corel、crysol等 软件；如果是复合物结构重建则需要用massha、sasref、crysol等软件