2.分子克隆及相关试验技术2分子生物学实验技术2.1分子克隆及相关实验技术2.1.1分子克隆2.1.2引物设计2.1.3 Gibson assembly2.1.4质粒抽提2.1.5化学法E.Coli感受态制备2.1.6电转化感受态制备2.1.7氯化法感受态2.1.8Trizol法提取真核细胞总RNA2.1.9体外逆转录2.1.10实时荧光定量PCR2.1.11 基因定点突变2.1分子克隆及相关实验技术2.1.1分子克隆质粒含目的基因的外源DNA限制性切+限制性酶切DNA连接酬+目的基因重组质粒非转化菌转化O筛选受体菌转化菌扩增简介（INTRODUCTION）完整的分子克隆可以简述为“分一切一→接→转一筛一→表”六个实验，如上图。PCR、酶切、连接、转化是传统基因克隆方法获得重组质粒必不可少的步骤。用PCR方法扩增要克隆的目的基因，限制性内切酶使插入片段和克隆载体之间建立互补配对的碱基序列，再经连接酶的连接反应完成插入片段和线性载体之间的重组。考虑到重组效率，通常要先将连接的产物转化到用于扩增质粒的克隆大肠杆菌感受态细胞中，进一步筛选正确的重组子。PCR：即多聚酶链式反应。它是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。反应过程分为三步：变性，退火，延伸。变性：双链DNA解旋形成单链。退火：特定引物与DNA单链模板结合。延伸：从5端向3’端延伸。酶切：限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异性位点上，并切割双链DNA。分子克隆实验中最常用的是II型酶，且是那些识别4个或6个碱基对
2. 分子克隆及相关试验技术 2 分子生物学实验技术 2.1分子克隆及相关实验技术 2.1.1 分子克隆 2.1.2 引物设计 2.1.3 Gibson assembly 2.1.4 质粒抽提 2.1.5 化学法E. Coli感受态制备 2.1.6 电转化感受态制备 2.1.7 氯化铷法感受态 2.1.8 Trizol 法提取真核细胞总RNA 2.1.9 体外逆转录 2.1.10 实时荧光定量PCR 2.1.11 基因定点突变 2.1 分子克隆及相关实验技术 2.1.1分子克隆 简介（INTRODUCTION） 完整的分子克隆可以简述为“分→切→接→转→筛→表”六个实验，如上图。PCR、酶切、连 接、转化是传统基因克隆方法获得重组质粒必不可少的步骤。用PCR方法扩增要克隆的目的基因，限 制性内切酶使插入片段和克隆载体之间建立互补配对的碱基序列，再经连接酶的连接反应完成插入 片段和线性载体之间的重组。考虑到重组效率，通常要先将连接的产物转化到用于扩增质粒的克隆 大肠杆菌感受态细胞中，进一步筛选正确的重组子。 PCR：即多聚酶链式反应。它是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是 生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加。反应过程分为三步：变 性，退火，延伸。变性：双链DNA解旋形成单链。退火：特定引物与DNA单链模板结合。延伸：从 5’端向3’端延伸。 酶切：限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特 异性位点上，并切割双链DNA。分子克隆实验中最常用的是Ⅱ型酶，且是那些识别4个或6个碱基对
的限制性内切酶。IⅡI型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序。切割后得到的是带粘性末端或平末端的线性DNA。连接：DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5-P末端与3-OH间形成3'.5-磷酸二酯键。一个DNA片段的5'-P末端与另一个3-OH末端相靠时互近，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+，ATP存在的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。常用的DNA连接酶是T4DNA连接酶，其作用底物是双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子，可以连接粘性末端、平未端。转化：体外连接的DNA分子必须尽快引入寄主细胞，否则会很快降解，而且只有导入到细胞中后，才能扩增及研究其功能的表达，细胞转化是常用也是最有效的方法之一，细菌转化是指裸露的（或纯化的）DNA被细菌吸收而导致基因转移的现象。大肠杆菌的感受态需诱导。将对数生长期的细菌放入0C的CaCI2低渗溶液中，细胞膨胀，形成原生质球，诱导感受态；DNA加入后，形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，粘附于原生质球表面，42C热冲击，DNA被吸收，将细胞混合物涂布于合适的（筛选）培养基培养几小时，细胞得以恢复和增殖，转化基因得以表达，然后根据合适的选择条件可以区分转化细胞和非转化细胞。材料（MATERIALS）口PCR试剂核酸模板、引物（1OμM，上下游引物）dNTPsMix、MgCI2、DNA聚合酶、HF或GCbuffer、DMSO、ddH20口酶切试剂限制性核酸酶切酶比如SalIHF、NotIHF、酶切buffer4、insertorvector口连接试剂T4DNA连接酶、10xT4DNA连接酶buffer口转化试剂感受态细胞（如DH5α、TOP10）、抗性LB平板、无菌无抗的SOC或LB培养基实验步骤（PROCEDURE）PCR部分：1.建立PCR反应体系（以Pfu-XIDNA聚合酶为例）试剂20 μL50 μL4 μL10 μL5xHF/GCBuffer10xdNTP(2.5mMeach)2 μL5 μL50mMMgCl20-0.2 μL0.5 μL0.2 μLPfu-XI polymerase0.2-0.5μLPrimers0.5μL+0.5μL1 μL+1 μL0.1-1 μLDNAtemplate0.1-1 μLDMSO*（一般不加）0.2 μL0.5 μLddH20Add to 20 μLAdd to50 μL选择薄壁的PCR管，按照上述体积系数，将上述物质依次加入混匀。关键步骤：酶催化反应通常最后加入酶，并冰上操作：DMSO能够减少模版二级结构，从而促进引物与模板的结合，但也会增加突变的概率；在执行PCR扩增程序时，最好每管20~50μL，过大的体积会使PCR仪中的反应溶液的温度变化的均一性降低，反应条件不准确；具体情况具体分析。2.建立PCR反应程序（以PfuDNA聚合酶为例）Pfu-XIDNA聚合酶常用的PCR扩增程序预变性98°℃ 1~5min变性98°℃10s28~35个循环退火62°℃10s延伸72°℃1kb/15~30s再延伸72℃5min保温12°℃10min
的限制性内切酶。Ⅱ型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序。切割后得到的是带粘性末端 或平末端的线性DNA。 连接：DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基的5’-P末端与3’-OH间形成3’,5’-磷酸二酯键。一个 DNA片段的5’-P末端与另一个3’-OH末端相靠时互近，在DNA连接酶的作用下，有Mg2+，ATP存在 的缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。常用的DNA连接酶是T4 DNA连接酶，其作用底物是 双链的DNA分子或RNA：DNA杂交分子，可以连接粘性末端、平末端。 转化：体外连接的DNA分子必须尽快引入寄主细胞，否则会很快降解，而且只有导入到细胞中后， 才能扩增及研究其功能的表达，细胞转化是常用也是最有效的方法之一，细菌转化是指裸露的（或 纯化的）DNA被细菌吸收而导致基因转移的现象。大肠杆菌的感受态需诱导。将对数生长期的细菌 放入0 °C的CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀，形成原生质球，诱导感受态；DNA加入后，形成抗DNase 的羟基-磷酸钙复合物，粘附于原生质球表面，42 °C热冲击，DNA被吸收，将细胞混合物涂布于合适 的（筛选）培养基培养几小时，细胞得以恢复和增殖，转化基因得以表达，然后根据合适的选择条 件可以区分转化细胞和非转化细胞。 材料（MATERIALS） r PCR试剂 核酸模板、引物（10 μM，上下游引物）、dNTPs Mix、MgCl2、DNA聚合酶、HF或GC buffer、 DMSO、ddH2O r 酶切试剂 限制性核酸酶切酶比如Sal I HF、Not I HF、酶切buffer 4、insert or vector r 连接试剂 T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶buffer r 转化试剂 感受态细胞（如DH5α、TOP10）、抗性LB平板、无菌无抗的SOC或LB培养基 实验步骤（PROCEDURE） PCR部分： 1.建立PCR反应体系（以Pfu-XI DNA聚合酶为例） 试剂 20 μL 50 μL 5×HF/GC Buffer 4 μL 10 μL 10×dNTP （2.5 mM each） 2 μL 5 μL 50 mM MgCl2 0-0.2 μL 0.5 μL Pfu-XI polymerase 0.2 μL 0.2-0.5 μL Primers 0.5 μL+0.5 μL 1 μL+1 μL DNA template 0.1-1 μL 0.1-1 μL DMSO*（一般不加） ddH2O 0.2 μL Add to 20 μL 0.5 μL Add to 50 μL 选择薄壁的PCR管，按照上述体积系数，将上述物质依次加入混匀。 ▲关键步骤： 酶催化反应通常最后加入酶，并冰上操作；DMSO能够减少模版二级结构，从而促进引物与模板的 结合，但也会增加突变的概率；在执行PCR扩增程序时，最好每管20~50 μL，过大的体积会使PCR 仪中的反应溶液的温度变化的均一性降低，反应条件不准确；具体情况具体分析。 2.建立PCR反应程序（以Pfu DNA聚合酶为例） Pfu-XI DNA聚合酶常用的PCR扩增程序 预变性 98 °C 1~5 min 28~35个循环 变性 98 °C 10 s 退火 62 °C 10 s 延伸 72 °C 1 kb/15~30 s 再延伸 72 °C 5 min 保温 12 °C 10 min
<关键步骤：不同的DNA聚合酶有不同的效率：Pfu-XI:1kb/20sec，Taq:1kb/1min;若是以菌落或菌液为模板，预变性时间可适当提高至3-5min；3.琼脂糖凝胶电泳实验鉴定PCR结果>选择合适的琼脂糖凝胶浓度及合适大小的DNAMarker。4.PCR产物纯化回收若条带产物较纯，推荐用PCR产物回收试剂盒回收，若条带较杂可用胶回收。操作步骤见试剂盒说明书。酶切部分：1.建立酶切体系：2.插入片段的酶切体系：插入片段可以是已经纯化回收的PCR产物或含有插入片段的质粒。以SalI/NotI系列的内切酶为例，酶切PCR产物的体系如下：PCR products1~2 μg10xbuffer310 μLSal I0.5 μLNot I0.5 μLH20Addto50μL放置于37C水浴锅，反应2~3h。注意事项JBy definition, 1 U restriction enzyme can cleave 1 μg DNA plasmid in I hour.Sal I, Sal I HF, Not I HF is20U/μL, which means in most cases, 0.5μLor10U ismore than enough选择合适的内切酶和该酶所对应的特定的酶切buffer，每种内切酶都有其高效反应buffer。如果不清楚双酶切的共用buffer时，建议去NEB官网查下具体的酶切信息http://nebbuffer：有些内切酶的反应可能要求加入BSA（胎牛血清中的一种球蛋白：牛血清白蛋白，是酶的稳定剂，防止酶的分解和非特异性吸附），是否添加可在NEB官网查到：刀严格控制酶切体系中的甘油浓度在10%以下，否则容易出现酶切的“星活性”现象，即酶切的专一性被放宽，酶切“序列识别”的严谨度下降（比如从严格识别的6个碱基才能酶切到只要识别4个相似碱基时就可以切割），不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点，出现乱切现象。乱切原因：a.低盐浓度（<25mM）：b.高pH值（>pH8.0）：c.存在有机溶剂（如DMSO、乙醇乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane等）；d.用其他二价离子替代镁离子（如Mn，Cu,Co，Zn等）。乱切解决办法：a.尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度；b.尽量避免有机溶剂(如制备DNA时引入的乙醇)的污染；c.将离子浓度提高到100~150mM（若酶活性不受离子强度影响)。3.酶切产物回收酶切产物试剂盒回收法或琼脂糖凝胶胶回收方法4.克隆载体酶切效果检测（可选步骤）：酶切后的载体和完整载体分别转化，对比转化结果。连接部分：1.建立连接反应体系：典型的体系为10μL反应体系（以T4ligase&10xligationbuffer为例）T4ligase10μL反应体系Insert(015×610×条带大小)+（1000×）μLVector0.015×610×条带大小+(1000×）μL10xligationbuffer1 μLT4 ligase1 μLH20Addto10μuL
▲关键步骤： ♫不同的DNA聚合酶有不同的效率：Pfu-XI：1 kb/20 sec，Taq：1 kb/1 min； ♫ 若是以菌落或菌液为模板，预变性时间可适当提高至3-5 min； 3.琼脂糖凝胶电泳实验鉴定 PCR 结果 ▲选择合适的琼脂糖凝胶浓度及合适大小的DNA Marker。 4.PCR 产物纯化回收 若条带产物较纯，推荐用PCR产物回收试剂盒回收，若条带较杂可用胶回收。操作步骤见试剂盒 说明书。 酶切部分： 1.建立酶切体系： 2.插入片段的酶切体系：插入片段可以是已经纯化回收的 PCR 产物或含有插入片段的质粒。以Sal I /Not I 系列的内切酶为例，酶切 PCR 产物的体系如下： PCR products 1~2 μg 10× buffer 3 10 μL Sal I 0.5 μL Not I H2O 0.5 μL Add to 50 μL 放置于37 °C水浴锅，反应2~3 h。 ▲注意事项 ♫ By definition, 1 U restriction enzyme can cleave 1 μg DNA plasmid in 1 hour. Sal I, Sal I HF, Not I HF is 20 U/μL, which means in most cases, 0.5 μL or 10 U is more than enough. ♫ 选择合适的内切酶和该酶所对应的特定的酶切buffer，每种内切酶都有其高效反应buffer。如果不 清楚双酶切的共用buffer时，建议去NEB官网查下具体的酶切信息http://nebbuffer； ♫ 有些内切酶的反应可能要求加入BSA（胎牛血清中的一种球蛋白：牛血清白蛋白，是酶的稳定 剂，防止酶的分解和非特异性吸附），是否添加可在NEB官网查到； ♫ 严格控制酶切体系中的甘油浓度在10%以下，否则容易出现酶切的“星活性”现象，即酶切的专 一性被放宽，酶切“序列识别”的严谨度下降（比如从严格识别的6个碱基才能酶切到只要识别4个 相似碱基时就可以切割），不但可以切断特异性的识别位点，还可以切断非特异性的位点，出现乱 切现象。 ♫ 乱切原因：a.低盐浓度（<25 mM）；b.高pH值（>pH 8.0）；c.存在有机溶剂（如DMSO、乙醇、 乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、sulphalane等）；d.用其他二价离子替代镁离子（如 Mn，Cu，Co，Zn 等）。 ♫ 乱切解决办法：a. 尽量用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓 度；b.尽量避免有机溶剂(如制备DNA时引入的乙醇)的污染；c.将离子浓度提高到100~150 mM (若酶 活性不受离子强度影响)。 3. 酶切产物回收 酶切产物试剂盒回收法或琼脂糖凝胶胶回收方法 4.克隆载体酶切效果检测（可选步骤）：酶切后的载体和完整载体分别转化，对比转化结果。 连接部分： 1. 建立连接反应体系：典型的体系为10 μL反应体系（以T4 ligase & 10×ligation buffer为例） T4 ligase 10 μL反应体系 Insert μL Vector μL 10×ligation buffer 1 μL T4 ligase H2O 1 μL Add to 10 μL
冰上操作，将上述物质加到PCR管中混匀，放置16C或室温反应过夜（8~12h）。为减少蒸发建议使用PCR管。关键步骤：载体酶切的质量是连接成功的关键。连接前要确保载体的酶切效果和浓度；连接体系以小体积建立，以增加分子碰撞的机会；合适的insert：vector比值对连接反应的成功贡献巨大。体积比例的设置依据各物质量比（和insert的大小和浓度相关），insert不低于0.3pmol。体积比值一般选择在1：1到1：8之间，增加insert的量主要是减少载体自连。NEB计算连接反应物质浓度：http://nebiocalculator.neb.com/#/dsdnaamt转化部分：1.从-80C取出感受态细胞放在冰上溶解（大约5min）。做好标记，建议同时取一管感受态细胞做空白对照；2.从4C冰箱取出抗性平板和SOC（根据连接的载体的抗性选择抗性筛选的LB平板），倒置平放在37°C恒温培养箱中孵育备用。设置水浴锅温度为42℃C；3.待感受态细胞的最后一粒冰融化时，取连接反应产物的一半（5uL）转到50L的感受态细胞中，指肚轻弹几下EP管底部混匀。冰上放置20~30min；4.轻轻取出转化管固定在浮板上，42°C热激45~90s。将EP管的1/2或2/3没于水中，定好闹钟。（60s通常是理想的热激时间，热激时间取决于所使用的感受态细胞）；5.冰上放置2~10min，再室温放置2min；6.超净台中取500uL无抗无菌的LBorSOC培养基，37°C摇床摇60min复苏细胞（将EP管倾斜45度放置，注意时间不要超过三个小时，此时杂菌可能成为优势菌）；7.4000rpm离心5min，取出37°C孵育的抗性平板并做好标记（质粒名称、抗性、感受态细胞名称、日期、姓名），在无菌操作台中倒掉离心后的上清至100-200证，重悬细胞，全部涂布到平板中（涂棒在使用前后在酒精灯外焰干烧一会儿以达到无菌，无菌玻璃珠用前用后要专门分开放置）；8.平板先正置放置在37C恒温培养箱放置10min，使菌液凝在培养基上（可选步骤）；9.将平板倒置放置在37°C恒温培养箱。培养16h（一般14~18个小时都正常，24小时后就会杂菌蔓延）。<关键步骤：转化最好做阴性（如感受态细胞、无抗培养基）或和“假阳性”（如空载体）对照，以确保转化操作是Work的，试剂也是可行的，如感受态、SOC/LB、抗性平板等：日对于特别大的质粒可以用电转化的方法，但一般很少用到，此处不作介绍：口因为转化后的培养时间较长，建议转化操作选在一天的下午进行，这样便于第二天上午观察检测结果。2.1.2引物设计简介（INTRODUCTION）引物设计是一小段单链DNA或RNA，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸出发点而起作用的多核苷酸链。通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。以目的基因为模板设计一对特异寡核苷酸引物，从而进行DNA的体外合成反应。在引物的3'-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3-OH，必须是游离的。PCR引物设计目的是在扩增特异性和扩增效率两个目标上取得平衡。基本原则（PRINCIPLE）1.引物长度一般引物长度为18~30碱基。确保退火温度不低于54C的最短的引物可获得最好的效率和特异性。每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。另外引物太长，PCR的最适延伸温度会超过聚合酶的最佳作用温度（70℃），从而降低产物的特异性。2.GC含量
冰上操作，将上述物质加到PCR管中混匀，放置16 °C或室温反应过夜（8~12 h）。为减少蒸发， 建议使用PCR管。 ▲关键步骤： 载体酶切的质量是连接成功的关键。连接前要确保载体的酶切效果和浓度；连接体系以小体积建 立，以增加分子碰撞的机会；合适的insert ：vector比值对连接反应的成功贡献巨大。体积比例的设 置依据各物质量比（和insert的大小和浓度相关），insert不低于0.3 pmol。体积比值一般选择在1：1 到 1 ： 8 之 间 ， 增 加 insert 的 量 主 要 是 减 少 载 体 自 连 。 NEB 计 算 连 接 反 应 物 质 浓 度 ： http://nebiocalculator.neb.com/#!/dsdnaamt 转化部分： 1.从-80 °C取出感受态细胞放在冰上溶解（大约5 min）。做好标记，建议同时取一管感受态细胞做空 白对照； 2.从4 °C冰箱取出抗性平板和SOC（根据连接的载体的抗性选择抗性筛选的LB平板），倒置平放在 37 °C恒温培养箱中孵育备用。设置水浴锅温度为42 °C； 3.待感受态细胞的最后一粒冰融化时，取连接反应产物的一半（5 μL）转到50 μL的感受态细胞中， 指肚轻弹几下EP管底部混匀。冰上放置20~30 min； 4. 轻轻取出转化管固定在浮板上，42 °C热激45~90 s。将EP管的1/2或2/3没于水中，定好闹钟。（60 s通常是理想的热激时间，热激时间取决于所使用的感受态细胞）； 5.冰上放置2~10 min，再室温放置2 min； 6.超净台中取500 μL无抗无菌的LB or SOC培养基，37 °C摇床摇60 min复苏细胞（将EP管倾斜45度 放置，注意时间不要超过三个小时，此时杂菌可能成为优势菌）； 7.4000 rpm离心5 min，取出37 °C孵育的抗性平板并做好标记（质粒名称、抗性、感受态细胞名称、 日期、姓名），在无菌操作台中倒掉离心后的上清至100−200 μL，重悬细胞，全部涂布到平板中 （涂棒在使用前后在酒精灯外焰干烧一会儿以达到无菌，无菌玻璃珠用前用后要专门分开放置）； 8.平板先正置放置在37 °C恒温培养箱放置10 min，使菌液凝在培养基上（可选步骤）； 9.将平板倒置放置在37 °C恒温培养箱。培养16 h（一般14~18个小时都正常，24小时后就会杂菌蔓 延）。 ▲关键步骤： ♫ 转化最好做阴性（如感受态细胞、无抗培养基）或和“假阳性”（如空载体）对照，以确保转化 操作是work的，试剂也是可行的，如感受态、SOC/LB、抗性平板等； ♫ 对于特别大的质粒可以用电转化的方法，但一般很少用到，此处不作介绍； ♫ 因为转化后的培养时间较长，建议转化操作选在一天的下午进行，这样便于第二天上午观察检测 结果。 2.1.2 引物设计 简介（INTRODUCTION） 引物设计是一小段单链DNA或RNA，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸出发点 而起作用的多核苷酸链。通常指的设计引物都是在已知模板序列的情况下进行。以目的基因为模板 设计一对特异寡核苷酸引物，从而进行DNA的体外合成反应。在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯链形 式进行合成，因此引物的3′-OH，必须是游离的。PCR引物设计目的是在扩增特异性和扩增效率两个 目标上取得平衡。 基本原则（PRINCIPLE） 1. 引物长度 一般引物长度为18~30碱基。确保退火温度不低于54 °C的最短的引物可获得最好的效率和特异性。 每增加一个核苷酸引物特异性提高4倍，这样，大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。引物长度 的上限并不很重要，主要与反应效率有关。由于熵的原因，引物越长，它退火结合到靶DNA上形成 供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小。另外引物太长，PCR的最适延伸温度会超过聚合酶 的最佳作用温度（70 °C），从而降低产物的特异性。 2. GC含量
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5”端加适量的A、T或G、C尾巴，并且相应的减少或增加引物的长度。3.退火温度（Tm值）一定盐浓度条件下，50°C寡核苷酸双链解链的温度。Tm值计算网站链接见附录。PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5~10°C。如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。一对引物的退火温度相差4~6°C不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在55~75℃间变化。4.模板的二级结构区域对于RT-PCR或Q-RT-PCR的引物设计，选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。但是对于蛋白的克隆表达，有时候必须要选择到二级结构区域作为模板，故酌情选择。5.引物的位置（主要针对RT-PCR或Q-RT-PCR检测引物的设计引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列，这样可减少引物与基因组的非特异结合，提高反应的特异性。若以cDNA为模板，则首先应尽量使引物和产物保持在mRNA的编码区域内；其次，尽量把引物放在不同的外显子上，以便使特异的PCR产物与从污染DNA中产生的产物在大小上相区别。6.引物自身的检查表达1）引物的二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，特别是引物的未端应避免回文结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。2)上下游引物的互补性：一个引物的3'末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。3）3未端：引物3”端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3”端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3端也不能形成任何二级结构和不能发生错配。如扩增编码区域，引物3，端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。如果可能的话，每个引物的3”末端碱基应为G或C。4）5'端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等：引入蛋白质结合DNA序列：引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。实验步骤（PROCEDURE）1.在NCBI（PUBMED）上搜索目的基因，找到该基因的mRNA序列，在CDS选项中，找到编码区所在位置，复制到SeBuilder建立序列文件。·对于RT-PCR和Q-RT-PCR所需的鉴定引物，建议用PrimerPremier5搜索最佳打分引物。即Tm值在55~70C之间，GC%含量在45~55%之间，上下游引物Tm相差2C以下，并且不存在发卡、二聚体、引物间交叉二聚体和错配等二级结构。·对于蛋白的克隆表达所需引物：Full-length蛋白的克隆，老老实实按照ATG·TAA起始密码子和终于密码子全部扩增出来。2.设计PCR引物时需要在酶切位点序列的外侧添加保护碱基以提高酶切时的活性。实验室常用保护碱基为：GTC、CTA针对性建议（TROUBLESHOOTING）1.引物纯化主要方式：无特殊实验要求，克隆实验一般推荐RPC纯化方式。2.一般默认模板序列排列方式是5-3'为主链，因此上游引物与模板是一致的，而下游引物是与模板序列反向互补的序列，在复制设计好的引物时切忌检查。本实验常用软件SeqBuilder里，标记引物使用filledarrow，方便于将设计好的引物直接复制粘贴。3.设计的引物太短，特异性降低；引物太长，影响产物的生成。建议结合引物序列GC含量和Tm值，选择最适的长度。值得注意的是引物的长度是指与模板DNA序列互补的部分，不包括为后续克
一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严 重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴，并且相应的减少或增加引物 的长度。 3. 退火温度（Tm值） 一定盐浓度条件下，50 °C寡核苷酸双链解链的温度。Tm值计算网站链接见附录。PCR扩增中的复 性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5~10 °C。如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度， 这样可以使PCR的特异性增加；如果碱基数较多，那么可以适当减低退火温度，使DNA双链结合。 一对引物的退火温度相差4~6 °C不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样 的，可以在55~75 °C间变化。 4. 模板的二级结构区域 对于RT-PCR或Q-RT-PCR的引物设计，选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。用有关计算 机软件可以预测估计目的片段的稳定二级结构，有助于选择模板。但是对于蛋白的克隆表达，有时 候必须要选择到二级结构区域作为模板，故酌情选择。 5. 引物的位置（主要针对RT-PCR或Q-RT-PCR检测引物的设计 引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列，这样可减少引物与基因组 的非特异结合，提高反应的特异性。若以cDNA为模板，则首先应尽量使引物和产物保持在mRNA的 编码区域内；其次，尽量把引物放在不同的外显子上，以便使特异的PCR产物与从污染DNA中产生 的产物在大小上相区别。 6. 引物自身的检查表达 1) 引物的二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构，特别是引物 的末端应避免回文结构，这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判 断，引物自身连续互补碱基不能大于3 bp。两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3’端的互补重 叠以防引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 2) 上下游引物的互补性：一个引物的3’末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。 3) 3’末端：引物3’端是延伸开始的地方，因此要防止错配就从这里开始。3’端不应超过3个连续 的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。3’端也不能形成任何二级结构和不能发生错 配。如扩增编码区域，引物3’端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响 扩增特异性与效率。如果可能的话，每个引物的3’末端碱基应为G或C。 4) 5’端对扩增特异性影响不大，因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5’端修饰包括： 加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合 DNA 序列；引入突变位点、 插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。额外的碱基或多或少会影响扩增的效率，还加大引物 二聚体形成的几率，但是为了下一步的操作就要作出适当的“牺牲”。 实验步骤（PROCEDURE） 1. 在NCBI（PUBMED）上搜索目的基因，找到该基因的mRNA序列，在CDS选项中，找到编码区所 在位置，复制到Seq Builder建立序列文件。 对于RT-PCR和Q-RT-PCR所需的鉴定引物，建议用Primer Premier5搜索最佳打分引物。即Tm 值在55~70 °C之间，GC%含量在45~55%之间，上下游引物Tm相差2 °C以下，并且不存在发 卡、二聚体、引物间交叉二聚体和错配等二级结构。 对于蛋白的克隆表达所需引物：Full-length蛋白的克隆，老老实实按照ATG.TAA起始密码子 和终于密码子全部扩增出来。 2. 设计PCR引物时需要在酶切位点序列的外侧添加保护碱基以提高酶切时的活性。实验室常用保护 碱基为：GTC、CTA 针对性建议（TROUBLESHOOTING） 1. 引物纯化主要方式：无特殊实验要求，克隆实验一般推荐RPC纯化方式。 2. 一般默认模板序列排列方式是5′-3′为主链，因此上游引物与模板是一致的，而下游引物是与模板 序列反向互补的序列，在复制设计好的引物时切忌检查。本实验常用软件Seq Builder里，标记引物使 用filled arrow，方便于将设计好的引物直接复制粘贴。 3. 设计的引物太短，特异性降低；引物太长，影响产物的生成。建议结合引物序列GC含量和Tm 值，选择最适的长度。值得注意的是引物的长度是指与模板DNA序列互补的部分，不包括为后续克