一些有大的非极性侧链的氨基酸的羧基端肽键。（4）肽段的氨基酸序列测定采用Edman降解法、酶解法等。酶解法：利用一种酶水解产生一个或两个可知末端特征的片段，再用另一种酶作用产生另一组片段，然后后一组片段进行色谱分离并进行末端测定，最后进行片段重叠分析，确定氨基酸序列。（5）肽段在多肽链中次序的推断采用肽段重叠法。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼出整条多肽链的氨基酸顺序。练习题有一多肽经酸水解后产生等摩尔的Lys，Gly和Ala，如用胰蛋白酶水解该肽，仅发现有游离的Glv和一种二肽。下列多肽的一级结构中，哪一个符合该肽的结构？A.Gly-Lys-Ala-Lys-Gly-AlaB.Ala-Lys-GlyC.Lys-Gly-AlaD.Gly-Lys-AlaE.Ala-Gly-Lys二、蛋白质的空间结构1.概念一—蛋白质的空间结构系非共价结构（1）含义：二级结构：指肽链借助氢键排列成沿一个方向具有周期性结构的构象，不涉及氮基酸残基的侧链构象。三级结构：指多肽链借助各种次级键盘绕成特定的不规则的球状结构的构象。四级结构：指寡聚蛋白质中各亚基之间排布上的相互关系或结合方式。（2）维持蛋白质分子构象的化学键①氢键：主要维持α-螺旋和β-折叠结构。②静电引力：也称离子键或盐键，对蛋白质构象稳定性贡献不大。③范德华力：对维持蛋白质活性中心构象非常重要。④疏水相互作用：维持蛋白质高级结构；③二硫键：两个硫原子之间形成的共价键。维持蛋白质构象的化学键主要是次级键。次级键：除共价键、离子键和金属键外基团间和分子间相互作用力的总称。（3）蛋白质分子中肽链的空间结构原则肽平面：两个旋转角：?（Cα-N)、（Cα-C）氨基酸残基侧链结构、极性造成空间位阻，使旋转角度不能超过0~土180°范围；C=O和N-H间的氢键也限制了二者的旋转
一些有大的非极性侧链的氨基酸的羧基端肽键。 （4）肽段的氨基酸序列测定 采用Edman降解法、酶解法等。 酶解法：利用一种酶水解产生一个或两个可知末端特征的片段，再用另一种酶 作用产生另一组片段，然后后一组片段进行色谱分离并进行末端测定，最后进行片 段重叠分析，确定氨基酸序列。 （5）肽段在多肽链中次序的推断 采用肽段重叠法。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑 出整条多肽链的氨基酸顺序。 练习题 有一多肽经酸水解后产生等摩尔的Lys，Gly和A1a，如用胰蛋白酶水解该肽，仅发 现有游离的Gly和一种二肽。下列多肽的一级结构中，哪一个符合该肽的结构? A.Gly-Lys-Ala-Lys-Gly-Ala B.Ala-Lys-Gly C.Lys-Gly-Ala D.Gly-Lys-Ala E.Ala-Gly-Lys 二、蛋白质的空间结构 1. 概念——蛋白质的空间结构系非共价结构 （1）含义： 二级结构：指肽链借助氢键排列成沿一个方向具有周期性结构的构象，不涉及 氨基酸残基的侧链构象。 三级结构：指多肽链借助各种次级键盘绕成特定的不规则的球状结构的构象。 四级结构：指寡聚蛋白质中各亚基之间排布上的相互关系或结合方式。 （2）维持蛋白质分子构象的化学键 ①氢键：主要维持-螺旋和-折叠结构。 ②静电引力：也称离子键或盐键，对蛋白质构象稳定性贡献不大。 ③范德华力：对维持蛋白质活性中心构象非常重要。 ④疏水相互作用：维持蛋白质高级结构； ⑤二硫键：两个硫原子之间形成的共价键。 维持蛋白质构象的化学键主要是次级键。次级键：除共价键、离子键和金属键 外基团间和分子间相互作用力的总称。 （3）蛋白质分子中肽链的空间结构原则 肽平面：两个旋转角：φ（C-N）、ψ（ C-C） 氨基酸残基侧链结构、极性造成空间位阻，使旋转角度不能超过 0~±180°范围； C=O 和 N-H 间的氢键也限制了二者的旋转
2.二级结构—肽链的螺旋折叠（1）α-螺旋(α-helix)1951年Pauling和Corey根据α-角蛋白(α-keratin)的X射线衍射结果提出的。①α-螺旋结构模型要点：a.主链围绕中心轴螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm，每个氨基酸残基沿轴上升0.15nm，每个氨基酸旋转100°。b.相邻螺圈之间形成链内氢键；c.R侧链在螺旋的外侧：d.天然蛋白质绝大多数为右手螺旋。②影响α-螺旋形成和稳定的因素a.氨基酸的组成和排列顺序：多聚丙氨酸（α-螺旋）：多聚赖氨酸（无规则卷曲）。遇到脯氨酸螺旋被中断或拐弯。b.氨基酸所带电荷性质c.R侧链的大小：空间位阻。（2）β-折叠(β-pleated sheet）①β-折叠结构要点a.肽链几乎是完全伸展的；b.肽链成锯齿状，按层平行排列，肽平面呈片状C.相邻肽链的C=O与N-H形成氢键，氢键几乎垂直于肽链；d.肽链的R侧链基团在肽平面的上下交替出现；e.折叠片以反平行式结构更稳定。②β-折叠与α-螺旋的转变：头发中的角蛋白。（3）β-转角(β-turn)指肽链出现的180°回折，由弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=0与第四个氨基酸残基的-NH之间形成氢键。Gly和Pro出现频率高。（4）无规则卷曲：没有确定规律性的部分肽链构象，肽链中肽键平面不规则排列属于松散的无规卷曲(randomcoil)。3.三级结构一一肽链非几何形的进一步折叠蛋白质的三级结构是指一条多肽链在二级结构基础上进一步卷曲折叠，构成一个不规则的特定构象。包括全部主链、侧链在内的所有原子的空间排布，但不包括肽链的相互作用。只有三级结构才是蛋白质生物活性的特征构象。维系三级结构的作用力：氢键、二硫键、离子键、疏水作用力和范德华力。4.四级结构—亚基间的相互关系蛋白质的四级结构：由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链通过非共价键键聚合而成的特定构象。四级结构的蛋白质中每个最小共价单位称为亚基。亚基一般由一条肽链组成
2. 二级结构——肽链的螺旋折叠 （1）-螺旋(- helix) 1951年Pauling和Corey根据-角蛋白(-keratin)的X射线衍射结果提出的。 ① -螺旋结构模型要点： a. 主链围绕中心轴螺旋上升，每3.6个氨基酸残基上升一圈，相当于0.54nm，每个氨 基酸残基沿轴上升0.15nm，每个氨基酸旋转100 °。 b. 相邻螺圈之间形成链内氢键； c. R侧链在螺旋的外侧； d. 天然蛋白质绝大多数为右手螺旋。 ②影响-螺旋形成和稳定的因素 a. 氨基酸的组成和排列顺序：多聚丙氨酸（ -螺旋）；多聚赖氨酸（无规则卷曲）。 遇到脯氨酸螺旋被中断或拐弯。 b. 氨基酸所带电荷性质 c. R侧链的大小：空间位阻。 （2）β-折叠(β-pleated sheet ) ①β-折叠结构要点 a. 肽链几乎是完全伸展的； b.肽链成锯齿状，按层平行排列，肽平面呈片状； c. 相邻肽链的C=O与N-H形成氢键，氢键几乎垂直于肽链； d. 肽链的R侧链基团在肽平面的上下交替出现； e. 折叠片以反平行式结构更稳定。 ② β-折叠与-螺旋的转变：头发中的角蛋白。 （3）-转角(- turn) 指肽链出现的180º回折，由弯曲处的第一个氨基酸残基的-C=O与第四个氨基酸 残基的-NH之间形成氢键。Gly和Pro出现频率高。 （4）无规则卷曲：没有确定规律性的部分肽链构象，肽链中肽键平面不规则排列， 属于松散的无规卷曲(random coil)。 3. 三级结构——肽链非几何形的进一步折叠 蛋白质的三级结构是指一条多肽链在二级结构基础上进一步卷曲折叠，构成一 个不规则的特定构象。包括全部主链、侧链在内的所有原子的空间排布，但不包括 肽链的相互作用。只有三级结构才是蛋白质生物活性的特征构象。 维系三级结构的作用力：氢键、二硫键、离子键、疏水作用力和范德华力。 4. 四级结构——亚基间的相互关系 蛋白质的四级结构：由两条或两条以上的具有三级结构的多肽链通过非共价键 键聚合而成的特定构象。 四级结构的蛋白质中每个最小共价单位称为亚基。亚基一般由一条肽链组成
四级结构涉及亚基的种类和数目以及各亚基在整个分子中的空间排布，包括亚基间的接触位点和相互作用关系。维持四级结构的主要作用力：疏水作用力。三、蛋白质结构与功能的统一性一级结构与功能的关系（1）同功蛋白质氨基酸的种属差异和分子进化同功蛋白质：不同种属来源的执行同种生物学功能的蛋白质；结构包括两部分：不变的氨基酸序列，决定蛋白质的空间结构和功能；可变的氯基酸序列：体现种属差异。同功蛋白质组成上的差异体现亲缘关系的远近，（2）同功蛋白质中氨基酸序列的个体差异和分子病同种蛋白质：同种生物具有相同生物活性的蛋白质：个体差异：同种蛋白质氨基酸序列的细微差异。引起分子病，个体蛋白质结构改变，导致生物学功能改变。（3）一级结构的局部断裂与蛋白质的激活血液凝固的生化机理；胰岛素原的激活。第五节蛋白质的性质一、蛋白质分子的大小1.相对分子质量一一蛋白质是巨大分子：相对分子质量一般为1万到几百万。2.测定方法一一蛋白质相对分子质量的测定（1）根据化学组成测定最低相对分子质量例如血红蛋白含铁量为0.335%，最低相对分子质量=55.84/0.335%~16700；其他方法测定血红蛋白分子量为68000。（2）物理化学方法测定蛋白质的相对分子质量渗透压测定法超离心法：包括沉降速度法（沉降系数S）和沉降平衡法（根据密度分离）。二、两性解离一—多价解离蛋白质的可解离基团主要指侧链的口解离基，包括基、基、咪座基、胍基、基、酚基等。蛋白质分子所带电荷的性质和数量是由蛋白质分子中的可解离基团的种类和数目以及溶液pH决定的。等电点一一蛋白质多种性质达到最低值。等电点时，蛋白质在电场中不移动。pH>等电点，蛋白质粒子带负电荷，向正极移动：pH<等电点，蛋白质粒子带正电荷，向负极移动。蛋白质在等电点时，因没有同性电荷排斥，故最不稳定，溶解度最小，易聚集成较大的颗粒，易沉淀析出（分离提纯蛋白质的方法）
四级结构涉及亚基的种类和数目以及各亚基在整个分子中的空间排布，包括亚基间 的接触位点和相互作用关系。 维持四级结构的主要作用力：疏水作用力。 三、蛋白质结构与功能的统一性 一级结构与功能的关系 （1）同功蛋白质氨基酸的种属差异和分子进化 同功蛋白质：不同种属来源的执行同种生物学功能的蛋白质； 结构包括两部分：不变的氨基酸序列，决定蛋白质的空间结构和功能；可变的 氨基酸序列：体现种属差异。同功蛋白质组成上的差异体现亲缘关系的远近。 （2）同功蛋白质中氨基酸序列的个体差异和分子病 同种蛋白质：同种生物具有相同生物活性的蛋白质； 个体差异：同种蛋白质氨基酸序列的细微差异。引起分子病，个体蛋白质结构 改变，导致生物学功能改变。 （3）一级结构的局部断裂与蛋白质的激活 血液凝固的生化机理；胰岛素原的激活。 第五节 蛋白质的性质 一、蛋白质分子的大小 1.相对分子质量——蛋白质是巨大分子：相对分子质量一般为1万到几百万。 2.测定方法——蛋白质相对分子质量的测定 （1）根据化学组成测定最低相对分子质量 例如血红蛋白含铁量为0.335%，最低相对分子质量=55.84/0.335%≈16700；其他 方法测定血红蛋白分子量为68000。 （2）物理化学方法测定蛋白质的相对分子质量 渗透压测定法 超离心法：包括沉降速度法（沉降系数S）和沉降平衡法（根据密度分离）。 二、两性解离——多价解离 蛋白质的可解离基团主要指侧链的可解离基团，包括氨基、羧基、咪唑基、胍 基、巯基、酚基等。蛋白质分子所带电荷的性质和数量是由蛋白质分子中的可解离 基团的种类和数目以及溶液pH决定的。 等电点——蛋白质多种性质达到最低值。等电点时，蛋白质在电场中不移动。 pH>等电点，蛋白质粒子带负电荷，向正极移动；pH<等电点，蛋白质粒子带正电 荷，向负极移动。 蛋白质在等电点时，因没有同性电荷排斥，故最不稳定，溶解度最小，易聚集 成较大的颗粒，易沉淀析出（分离提纯蛋白质的方法）
电泳：带电质点在电场中向电荷相反的电极泳动的现象。实验室、生产、临床诊断等常用电泳分离蛋白质和鉴定蛋白质纯度。三、胶体性质1.胶体性质—亲水胶体胶体形成条件：粒子大小在1~100nm之间；带相同电荷：与溶剂之间形成溶剂化层。蛋白质：2~20nm。2.渗析渗析或透析：蛋白质不能透过半透膜，可将其与一些小分子物质分开。超滤：利用外加压力或离心力使水和其他小分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上。四、沉淀作用1.蛋白质溶液的稳定因素：水化层：蛋白质分子表面的亲水基团(-COOH、-OH、-SH、-CONH2等）+水；带电层：表面可解离基团在一定pH环境下解离产生，同性电荷相互排斥。蛋白质的沉淀作用：条件改变时，蛋白质溶液稳定性被破坏，蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象。原因：破坏水化层和带电层。2、沉淀方法：（1）盐析高浓度中性盐、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂等都可引起蛋白质沉淀。加入高浓度的中性盐（如NH4l2SO4、NaCI等），可有效破坏蛋白质颗粒的水化层，同时又中和了蛋白质的电荷，使蛋白质产生沉淀。这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称为盐析(saltingout)。当除去盐后，可再溶解。盐析法是最常用的分离蛋白质的方法。（2）有机溶剂沉淀法：可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲和力很大，能破环蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。调节蛋白质溶液至等电点时，加入有机溶剂可加速蛋白质沉淀。常温下有机溶剂沉淀蛋白质往往引起变性。在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备蛋白质。（3）重金属盐沉淀法：当溶液pH值高于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，它易与重金属离子（Hg2+Pb2+、Cu2+、Ag*）结合成不溶性盐而沉淀。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，误食重金属盐后可大量饮用牛奶或豆浆等蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐出来解毒。若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的蛋白质。（4）生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于等电点时蛋白质带正电荷，易与带负电（酸根阴离子）的生物碱试剂（如
电泳：带电质点在电场中向电荷相反的电极泳动的现象。实验室、生产、临床 诊断等常用电泳分离蛋白质和鉴定蛋白质纯度。 三、胶体性质 1. 胶体性质——亲水胶体 胶体形成条件：粒子大小在1~100nm之间；带相同电荷；与溶剂之间形成溶剂 化层。蛋白质：2~20nm。 2.渗析 渗析或透析：蛋白质不能透过半透膜，可将其与一些小分子物质分开。 超滤：利用外加压力或离心力使水和其他小分子通过半透膜，而蛋白质留在膜 上。 四、沉淀作用 1. 蛋白质溶液的稳定因素： 水化层：蛋白质分子表面的亲水基团(-COOH、-OH、-SH、-CONH2 等）+水； 带电层：表面可解离基团在一定pH环境下解离产生，同性电荷相互排斥。 蛋白质的沉淀作用：条件改变时，蛋白质溶液稳定性被破坏，蛋白质分子相互 聚集而从溶液中析出的现象。 原因：破坏水化层和带电层。 2. 沉淀方法： （1）盐析 高浓度中性盐、有机溶剂、重金属盐、生物碱试剂等都可引起蛋白质沉淀。加 入高浓度的中性盐（如[NH4]2SO4、NaCl等），可有效破坏蛋白质颗粒的水化层，同 时又中和了蛋白质的电荷，使蛋白质产生沉淀。这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象 称为盐析(salting out)。当除去盐后，可再溶解。盐析法是最常用的分离蛋白质的方 法。 （2）有机溶剂沉淀法：可与水混合的有机溶剂，如酒精、甲醇、丙酮等，对水的亲 和力很大，能破坏蛋白质颗粒的水化膜，使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。调节蛋白 质溶液至等电点时，加入有机溶剂可加速蛋白质沉淀。常温下有机溶剂沉淀蛋白质 往往引起变性。在低温条件下，则变性进行较缓慢，可用于分离制备蛋白质。 （3）重金属盐沉淀法： 当溶液pH值高于等电点时，蛋白质颗粒带负电荷，它易与重金属离子（Hg2+、 Pb2+、Cu2+、Ag+）结合成不溶性盐而沉淀。重金属沉淀的蛋白质常是变性的，误食 重金属盐后可大量饮用牛奶或豆浆等蛋白质，然后用催吐剂将结合的重金属盐呕吐 出来解毒。若在低温条件下，并控制重金属离子浓度，也可用于分离制备不变性的 蛋白质。 （4）生物碱试剂和某些酸类沉淀法： pH小于等电点时蛋白质带正电荷，易与带负电（酸根阴离子）的生物碱试剂(如
苦味酸、钨酸、酸)以及某些酸（如三氯醋酸、过氯酸、硝酸）生成不溶性盐而沉淀。血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿中蛋白质。五、蛋白质的变性作用蛋白质因受理化因素影响，使其维系空间结构的次级键受到破坏，使蛋白质的理化性质和生物活性改变或丧失，称为变性作用(denaturation)。引起蛋白质发生变性的因素：化学因素：强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)、苦味酸、乙醇等。物理因素：加热(70℃~100℃)、加压、脱水、剧烈振荡或搅拌、紫外线、X-射线照射、超声波等。维持蛋白质空间结构的次级键被破坏，一级结构的共价键（肽键）没有被破坏。分为可逆变性和不可逆变性。变性后的特点：①丧失生物活性；②溶解度降低；③易被水解（对水解酶的抵抗力减弱）。应用：变性因素常用于消毒及灭菌；保存蛋白质制剂时应注意防止蛋白质变性。六、颜色反应①双缩脲反应(BiuretReaction)蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色（540nm），称双缩脲反应。凡分子中含有两个或两个以上肽键的化合物都呈此反应，所有蛋白质都能与双缩脲试剂发生反应。1AH2N-H2N-H2NCNHCNH2+ NH1C=0+=O180℃H2NH2NHHH2NC=C=0OH+ Cu2+NHHNNHC=OC=O20=H2N-1HH②节三酮反应(NinhydrinReaction)α-氨基酸和所有蛋白质均可与水合三酮作用产生蓝色反应。③米隆反应(MillonReaction）蛋白质溶液中加入米隆试剂（亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液），蛋白质首先
苦味酸、钨酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、过氯酸、硝酸) 生成不溶性盐而沉淀。 血液化学分析时常利用此原理除去血液中的蛋白质，此类沉淀反应也可用于检验尿 中蛋白质。 五、蛋白质的变性作用 蛋白质因受理化因素影响，使其维系空间结构的次级键受到破坏，使蛋白质的 理化性质和生物活性改变或丧失，称为变性作用(denaturation)。 引起蛋白质发生变性的因素： 化学因素：强酸、强碱、尿素、胍、去污剂、重金属盐、十二烷基磺酸钠(SDS)、 苦味酸、乙醇等。 物理因素：加热(70℃~100℃)、加压、脱水、剧烈振荡或搅拌、紫外线、X-射 线照射、超声波等。 维持蛋白质空间结构的次级键被破坏，一级结构的共价键（肽键）没有被破坏。 分为可逆变性和不可逆变性。 变性后的特点： ① 丧失生物活性；② 溶解度降低；③ 易被水解（对水解酶 的抵抗力减弱）。 应用：变性因素常用于消毒及灭菌；保存蛋白质制剂时应注意防止蛋白质变性。 六、颜色反应 ①双缩脲反应(Biuret Reaction) 蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色（540nm），称双缩脲反应。凡 分子中含有两个或两个以上肽键的化合物都呈此反应，所有蛋白质都能与双缩脲试 剂发生反应。 ②茚三酮反应(Ninhydrin Reaction) α-氨基酸和所有蛋白质均可与水合茚三酮作用产生蓝色反应。 ③米隆反应(Millon Reaction) 蛋白质溶液中加入米隆试剂(亚硝酸汞、硝酸汞及硝酸的混合液)，蛋白质首先