根据New England Biolabs公司对T4DNA连接酶的定义，IU的酶可在l6C30min内连 接20uL体系中HidⅢ酶切片段（黏性末端为0.12umo/L5末端，此时DNA质量浓度约为 300gL)的50%。连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍，厂商为了满足这一要求， 又往往提供高浓度的酶（几百个单位L),所以进行黏末端连接时需先行稀释。除了立即用 于反应的部分可用醇反应缓冲液稀释外，其余都应使用厂商提供的稀释液。稀释液的成分与 酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。 【复习思考题】 1.什么是DNA重组？它包括哪些因素？ 2.如何提高DNA的重组效率？ 3.连接反应的温度选择的依据是什么？ 4.通过什么手段可以降低质粒自身环化的数量？ 5.DNA连接酶的种类有哪几种？ 实验四大肠杆菌感受态细胞的制备和转化效率检测 【实验目的】 通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。 【实验原理】 体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。研 究发现，用含Ca2·的溶液处理大肠杆菌细胞会使细胞易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外 源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化方法可以 诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaC2法。 CaC2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C、CaCl 低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经 42C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。 本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞，用CaCl,处理受体菌使其处于感受态，之后通过 转化实验检测感受态细胞的转化效率，转化的原理及操作步骤参考实验五
18 根据 New England Biolabs 公司对 T4 DNA 连接酶的定义，1U 的酶可在 16℃ 30min 内连 接 20μL 体系中 Hind Ⅲ酶切片段（黏性末端为 0.12μmol/L 5’末端，此时 DNA 质量浓度约为 300ng/μL）的 50%。连接平末端时酶用量要比连接黏端大 10-100 倍，厂商为了满足这一要求， 又往往提供高浓度的酶（几百个单位/μL），所以进行黏末端连接时需先行稀释。除了立即用 于反应的部分可用酶反应缓冲液稀释外，其余都应使用厂商提供的稀释液。稀释液的成分与 酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用。 【复习思考题】 1. 什么是 DNA 重组？它包括哪些因素？ 2. 如何提高 DNA 的重组效率？ 3. 连接反应的温度选择的依据是什么？ 4. 通过什么手段可以降低质粒自身环化的数量？ 5. DNA 连接酶的种类有哪几种？ 实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化效率检测 【实验目的】 通过本实验掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法。 【实验原理】 体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。研 究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会使细胞易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外 源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化方法可以 诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCl2法。 CaCl2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于 0°C 、CaCl2 低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经 42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。 本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，之后通过 转化实验检测感受态细胞的转化效率，转化的原理及操作步骤参考实验五
【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅、超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温 箱、-70℃冰箱、4-20℃冰箱、制冰机、50mL离心管、小指管、试管、培养皿、锥形瓶等、 玻璃涂棒、镊子、牙签、酒精灯、微量移液器(10、100、1000uL量程各一支)、吸头、1.5 mlEP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品 胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠(NaCI)、氯化钙(CaC2)。 三、试剂 1.1mol/L CaCl2溶液 2.1mol/L MgCl溶液 3.75%甘油 4.LB液体培养基 配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入. 胰蛋白陈(bacto-typtone) 10g 酵母提取物(bacto-yeast extract)Sg NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0（每升加1mol/LNaOH475L) 加入去离子水至总体积为1L,121℃湿热灭菌20min。 【实验步骤】 1.从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mLLB液体培养基的试管中，37℃ 振荡培养过夜。 2.次日，按1：100(VVW),即取1mL菌液转接到一个含有100mLLB液体培养基锥形瓶 中，37℃振荡培养2-3h。(此时，OD600≤0.3-0.5，此为实验成功的关键)。 3.将菌液转移到50mL冰浴好的离心管中，冰上放置10min。 4.离心10min(3,500pm),回收细胞。 9
19 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅、超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温 箱、-70℃冰箱、4/-20℃ 冰箱、制冰机、50 mL 离心管、小指管、试管、培养皿、锥形瓶等、 玻璃涂棒、镊子、牙签、酒精灯、微量移液器（10、100、1000μL 量程各一支）、吸头、1.5 ml EP 管、PE 手套和乳胶手套。 二、药品 胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠（NaCl ) 、氯化钙（CaCl2 ) 。 三、试剂 1. 1 mol / L CaCl2 溶液 2. 1 mol / L MgCl2 溶液 3. 75% 甘油 4. LB 液体培养基 配制每升培养基，应在 950 mL 去离子水中加入． 胰蛋白陈（bacto-typtone ) 10g 酵母提取物（bacto-yeast extract ) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用 NaOH 调节 pH 至 7.0 （每升加 1 mol / L NaOH 475 μL ） 加入去离子水至总体积为 1 L , 121 ℃ 湿热灭菌 20 min 。 【实验步骤】 1. 从大肠杆菌 DH5α 平板上挑取一个单菌落接于 2 mL LB 液体培养基的试管中，37 ℃ 振荡培养过夜。 2. 次日，按 1:100(V/V)，即取 1 mL 菌液转接到一个含有 100 mL LB 液体培养基锥形瓶 中，37 ℃ 振荡培养 2-3 h。（此时，OD600 ≤ 0.3-0.5，此为实验成功的关键）。 3. 将菌液转移到 50 mL 冰浴好的离心管中，冰上放置 10 min。 4. 离心 10 min (3,500 rpm)，回收细胞
5.倒出培养液，将管倒置，以便培养液流尽。 6.将菌体重悬于1/10体积的终浓度为20 nM CaCl2和80 mM MgCla2的混合溶液中。（务 必放冰上)。 7.4℃3500pm/min,离心10min,回收细胞。 8.将菌体重悬于1/50体积冰冷的0.1 mol/LCaCl2.溶液中。（务必放冰上）。此细胞为感受 态细胞。于4℃冰箱中保存，一周内使用或将菌体悬浮于1/50体积冰冷的含有15%甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液中，分装，每100uL一份，液氯速冻，置于一80℃。 【实验安排】 本实验约需要两天。 【注意事项】 1.实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源DNA的污染。 2.实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。 3.整个实验过程均需置于冰上。 4.选用对数生长期细胞，OD6oo不应高于0.6。 【复习思考题】 1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？ 2.影响转化效率的因素有哪些？ 3.制备感受态细胞的过程中需要注意的问题？ 4.制备感受态细胞的原理是什么？ 5.制备感受态细胞时细菌的最佳的生长状态？ 实验五重组质粒的转化 【实验目的】 通过本实验，掌握重组质粒的转化方法和原理。 【实验原理】 20
20 5. 倒出培养液，将管倒置，以便培养液流尽。 6. 将菌体重悬于 1/10 体积的终浓度为 20mM CaCl2 和 80 mM MgCl2的混合溶液中。（务 必放冰上）。 7. 4 ℃ 3500 rpm/min，离心 10 min，回收细胞。 8. 将菌体重悬于 1/50 体积冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液中。（务必放冰上）。此细胞为感受 态细胞。于 4℃冰箱中保存，一周内使用或将菌体悬浮于 1/50 体积冰冷的含有 15%甘油的 0.1 mol/L CaCl2溶液中，分装，每 100μL一份，液氮速冻，置于－80℃。 【实验安排】 本实验约需要两天。 【注意事项】 1. 实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源 DNA 的污染。 2. 实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。 3. 整个实验过程均需置于冰上。 4. 选用对数生长期细胞，OD600不应高于 0.6。 【复习思考题】 1. 感受态细胞有何特点？如何保证它的质量？ 2. 影响转化效率的因素有哪些？ 3. 制备感受态细胞的过程中需要注意的问题？ 4. 制备感受态细胞的原理是什么？ 5. 制备感受态细胞时细菌的最佳的生长状态？ 实验五 重组质粒的转化 【实验目的】 通过本实验，掌握重组质粒的转化方法和原理。 【实验原理】
经CCl法制备的感受态细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42C 短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。 本实验采用E.c0DH5a菌株感受态细胞，与以上实验所得重组连接的质粒载体共保温 实现转化。 重组质粒转化宿主细胞后，需对转化菌落进行筛选鉴定。本实验利用α互补现象进行筛 选（即蓝白斑筛选）。蓝白斑筛选是最常用的一种鉴定方法。-肽是大肠杆菌acZ基因编码 的B半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片段。B半乳糖苷酶只有在4聚体的状态下才有酶活性， 缺失-肽则不能形成4聚体。但剩余的阝半乳糖苷酶C端的大部分在遇到α-肽后仍然能形 成4聚体而恢复酶活性，这种现象称为α互补。阝半乳糖苷酶的酶活性能把无色的化合物 X-gl(5-溴-4氯-3-哚-B-D-半乳糖)分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴4-氯靛蓝，因 此，该反应可作为一个选择标记。该筛选系统的载体（如pCF-T载体）上有a-肽基因lacZ, 要求其宿主菌缺失lacZ',保留C端酶活性区域。人们已经制作了lacZ缺失（△acZ)的大 肠杆菌菌株作为基因克隆的受体菌，常用的有DH5a、JM101、JM103、JM105、JM109、NM522 等。载体1acZ基因的编码区中插入了一个多克隆位点(MCS),它并不破坏读框，但可使少 数几个氨基酸插入-肽的氨基端而不影响功能。载体在这些菌株中复制，当培养基中加入诱 导物（乳糖或PTG),就会发生a-互补作用，从而把培养基中的Xgl分解为蓝色，菌落为 蓝色。当载体的MCS中插入外源DNA时，a-肽被破坏，不能发生a-互补，培养基中的X-gal 仍然是完整的无色物质，菌落为白色。因此，按照菌落的颜色就可以确定载体上是否插入了 外源基因。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、恒温水浴器、吸头、EP管、培养皿、玻璃涂棒、 镊子、牙签、酒精灯、制冰机。 二、药品 胰蛋白陈、酵母提取物、氯化钠(NaC)、氨苄青霉素、二甲基甲酰胺、X-gal(5-溴-4 氯3-哚-B-D半乳糖)、PTG(异丙基-B-D-硫代半乳糖苷)
21 经CaCl2法制备的感受态细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经 42°C 短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。 本实验采用 E.coli DH5α 菌株感受态细胞，与以上实验所得重组连接的质粒载体共保温 实现转化。 重组质粒转化宿主细胞后，需对转化菌落进行筛选鉴定。本实验利用 α 互补现象进行筛 选（即蓝白斑筛选）。蓝白斑筛选是最常用的一种鉴定方法。α-肽是大肠杆菌 lacZ 基因编码 的 β-半乳糖苷酶 N 端的一段氨基酸片段。β-半乳糖苷酶只有在 4 聚体的状态下才有酶活性， 缺失 α-肽则不能形成 4 聚体。但剩余的 β-半乳糖苷酶 C 端的大部分在遇到 α-肽后仍然能形 成 4 聚体而恢复酶活性，这种现象称为 α 互补。 β-半乳糖苷酶的酶活性能把无色的化合物 X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）分解成半乳糖和一个深蓝色的物质 5-溴-4-氯靛蓝，因 此，该反应可作为一个选择标记。该筛选系统的载体（如 pCF-T 载体）上有 α-肽基因 lacZ’， 要求其宿主菌缺失 lacZ’，保留 C 端酶活性区域。人们已经制作了 lacZ’缺失（ΔlacZ’）的大 肠杆菌菌株作为基因克隆的受体菌，常用的有 DH5 α、JM101、JM103、JM105、JM109、NM522 等。载体 lacZ’基因的编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少 数几个氨基酸插入 α-肽的氨基端而不影响功能。载体在这些菌株中复制，当培养基中加入诱 导物（乳糖或 IPTG），就会发生 α-互补作用，从而把培养基中的 X-gal 分解为蓝色，菌落为 蓝色。当载体的 MCS 中插入外源 DNA 时，α-肽被破坏，不能发生 α-互补，培养基中的 X-gal 仍然是完整的无色物质，菌落为白色。因此，按照菌落的颜色就可以确定载体上是否插入了 外源基因。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、恒温水浴器、吸头、EP 管、培养皿、玻璃涂棒、 镊子、牙签、酒精灯、制冰机。 二、药品 胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠（NaCl)、氨苄青霉素、二甲基甲酰胺、X-gal（5-溴-4- 氯-3-吲哚-β-D-半乳糖）、IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）
三、试剂 1.氨苄青霉素(Amp),用无菌水配制成50mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。 2.LB固体培养基：每升LB培养基中加15g琼脂。 3.X-gal贮存液：将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg/mL溶液，不需过滤灭菌， 分装小包装，避光贮存于-20℃。 4.1PTG贮存液：取0.2gPTG溶于3mL双蒸水中，再用双蒸水定容4mL,配成50mg /mL,用0.22m滤膜过滤除菌，每份500uL,贮存于-20℃。 【实验步骤】 1.取1O0uL新鲜配制的感受态细胞，加入实验三所得重组质粒DNA1μL(50g）混 匀，冰上放置30min。 2.将管放到42℃水浴锅中，热激90sec。 3.冰浴2min。 4.每管加500uL室温LB液体培养基（轻轻混匀），37℃温育45min,130rpm慢摇。 5.在预制的LB琼脂平板上，加40uL20mg/mL的Xgal和16uL50mg/mL的 PTG溶液，并用灭菌玻璃棒（酒精灯上烧后冷却）均匀涂布于琼脂凝胶表面，37℃温箱 中放置30min。 6.将适当体积(100uL)己转化的感受态细胞均匀涂在含有氨苄青霉素(50ug/mL) 的LB平板上，晾至液体被吸收。 7.倒置平皿37℃培养12-16h,出现菌落。培养皿上的会长出蓝色和白色菌落，其中 白色菌落为含有重组DNA质粒的菌落。 【实验结果】 经12I6培养后，培养皿上生长着很多白色菌落和蓝色菌落，白色菌落为DNA重组 子（图51），而转化普通连接产物的培养皿上则只长出白色菌落
22 三、试剂 1. 氨苄青霉素（Amp ) ，用无菌水配制成 50 mg / mL 溶液，置-20℃冰箱保存。 2. LB 固体培养基：每升 LB 培养基中加 15g 琼脂。 3. X-gal 贮存液 ：将 X-gal 溶于二甲基甲酰胺，配成 20 mg / mL 溶液，不需过滤灭菌， 分装小包装，避光贮存于 -20 ℃ 。 4. IPTG 贮存液：取 0.2g IPTG 溶于 3 mL 双蒸水中，再用双蒸水定容 4 mL ，配成 50 mg / mL，用 0.22 μm 滤膜过滤除菌，每份 500μL ，贮存于-20 ℃ 。 【实验步骤】 1. 取 100 μL 新鲜配制的感受态细胞，加入实验三所得重组质粒 DNA1 μL ( 50 ng ）混 匀，冰上放置 30 min。 2. 将管放到 42 ℃ 水浴锅中，热激 90sec。 3. 冰浴 2 min 。 4. 每管加 500μL 室温 LB 液体培养基（轻轻混匀），37 ℃ 温育 45 min ，130rpm 慢摇。 5. 在预制的 LB 琼脂平板上，加 40μL 20 mg / mL 的 Xgal 和 16μL 50 mg / mL 的 IPTG 溶液，并用灭菌玻璃棒（酒精灯上烧后冷却）均匀涂布于琼脂凝胶表面，37 ℃ 温箱 中放置 30 min。 6. 将适当体积（100μL）已转化的感受态细胞均匀涂在含有氨苄青霉素（50μg／mL ） 的ＬＢ平板上，晾至液体被吸收。 7. 倒置平皿 37 ℃ 培养 12-16h ，出现菌落。培养皿上的会长出蓝色和白色菌落，其中 白色菌落为含有重组 DNA 质粒的菌落。 【实验结果】 经 12 -16h 培养后，培养皿上生长着很多白色菌落和蓝色菌落，白色菌落为 DNA 重组 子（图 5- l ），而转化普通连接产物的培养皿上则只长出白色菌落