o.0.o 结果照片图 实验5-1 结果示意图 【实验安排】 本实验约需要一天。铺琼脂板，细胞转化，倒置平皿37℃培养过夜(12-16h)。 【注意事项】 1.实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源DNA的污染。 2.实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。 3.整个实验过程均需置于冰上。 【复习思考题】 1.什么是转化，转化中要注意哪些问题？ 2.影响转化效率的因素有哪些？ 3.蓝白斑筛选的原理是什么？ 4.X-gal和PTG在蓝白斑筛选中的作用？ 实验六重组质粒DNA的提取及酶切鉴定 【实验原理】 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA,大小范围从1kb至20Okb以上不等。各种质粒都是 存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地 2
实验 5-1 【实验安排】 本实验约需要一天。铺琼脂板，细胞转化，倒置平皿 37 ℃ 培养过夜（12-16h ）。 【注意事项】 1. 实验中所用的器皿均要灭菌，以防止杂菌和外源 DNA 的污染。 2. 实验过程中要注意无菌操作，溶液移取、分装等均应在无菌超净工作台上进行。 3. 整个实验过程均需置于冰上。 【复习思考题】 1. 什么是转化，转化中要注意哪些问题？ 2. 影响转化效率的因素有哪些？ 3. 蓝白斑筛选的原理是什么？ 4. X-gal 和 IPTG 在蓝白斑筛选中的作用？ 实验六 重组质粒 DNA 的提取及酶切鉴定 【实验原理】 细菌质粒是一类双链、闭环的 DNA，大小范围从 1kb 至 200kb 以上不等。各种质粒都是 存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地 23
处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的 复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 一般分离质粒DNA的方法都包括3个步骤：①培养细菌，使质粒DNA大量扩增：②收 集和裂解细菌：③分离和纯化质粒DNA。分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法 有碱裂解法、煮沸法、$DS法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、 质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验介绍碱裂解 法提取质粒DNA。 碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上 的差异来分离质粒DNA。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结 构解开而被变性，在这样的条件下，尽管共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补 链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性 时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而 线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互 缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒DNA恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心， 染色体DNA与不稳定的大分子RNA,蛋白质SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用 酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒DNA。 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在 于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为1、Ⅱ、 Ⅲ型三大类。其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶 限制性内切酶识别序列长度一般为4~8个呈回文序列的特异核苷酸对。一般情况下， 识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。许多限制性内切酶的酶切 位点已被确定。例如E©oR!酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。 5.GAATTC.3 3'.CTTAAG.5' EcoRI以独特的方式识别并裂解这个顺序，形成两个5'突出末端： 24
24 处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的 复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 一般分离质粒 DNA 的方法都包括 3 个步骤：①培养细菌，使质粒 DNA 大量扩增；②收 集和裂解细菌；③分离和纯化质粒 DNA。分离制备质粒 DNA 的方法很多，其中常用的方法 有碱裂解法、煮沸法、SDS 法、羟基磷灰石层析法等。在实际操作中可以根据宿主菌株类型、 质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒 DNA 的用途进行选择。本实验介绍碱裂解 法提取质粒 DNA。 碱裂解法提取质粒 DNA 是根据共价闭合环状质粒 DNA 和线性染色体 DNA 在拓扑学上 的差异来分离质粒 DNA。在 pH 值介于 12.0-12.5 这个狭窄的范围内，线性的 DNA 双螺旋结 构解开而被变性，在这样的条件下，尽管共价闭环质粒 DNA 的氢键会被断裂，但两条互补 链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入 pH4.8 乙酸钾高盐缓冲液恢复 pH 至中性 时，因为共价闭合环状的质粒 DNA 的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而 线性的染色体 DNA 的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们相互 缠绕形成不溶性网状结构，而复性的质粒 DNA 恢复原来构型，保持可溶性状态。通过离心， 染色体 DNA 与不稳定的大分子 RNA，蛋白质-SDS 复合物等一起沉淀下来而被除去，最后用 酚氯仿抽提纯化上清液中的质粒 DNA。 限制性内切酶是一类能识别双链 DNA 分子中特异核苷酸序列的 DNA 水解酶，主要存在 于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ型三大类。其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。 限制性内切酶识别序列长度一般为 4～8 个呈回文序列的特异核苷酸对。一般情况下， 识别序列越长，在同一 DNA 分子中识别位点出现的频率就越小。许多限制性内切酶的酶切 位点已被确定。例如 EcoRl 酶的识别与切割序列为以下 6 个碱基对。 5′.GAATTC.3′ 3′.CTT AAG. 5′ EcoR I 以独特的方式识别并裂解这个顺序，形成两个 5′突出末端：
5'.G AATTC.3' 3'.CTTAA G.5 这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoRI产生的其它分子末 端相连接。 限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目 的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。根据酶切目的和要求不同，可 有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应 和大量的酶切反应。小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20L,含0.2~1g DNA,大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50~1O0L,DNA用量在10~30μg。 本实验以HidⅢ对本实验中提取的重组质粒进行小量酶切鉴定。在用特定的限制性内 切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、EP管、水浴锅、离心管、移液器、 吸头、制冰机、琼脂糖凝胶电泳设备、微量移液器(10、100、1000L量程各一支)1.5ml EP管、PE手套和乳胶手套。 二、试剂 1.质粒提取试剂盒（博大泰克） 溶液I 溶液Ⅱ 溶液Ⅲ 结合缓冲液 浓缩漂洗液 洗脱缓冲液 离心吸附柱 2.HindⅢ限制性内切核酸酶 3
25 5′.G AATTC.3′ 3′.CTT AA G.5′ 这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由 EcoR I 产生的其它分子末 端相连接。 限制性内切酶主要用于基因组 DNA 的片段化、重组 DNA 分子的构建与鉴定、载体中目 的基因片段的分离与回收以及 DNA 分子物理图谱的构建等。根据酶切目的和要求不同，可 有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应 和大量的酶切反应。小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为 20 μL, 含 0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为 50～100 μL，DNA 用量在 10～30μg。 本实验以 Hind III 对本实验中提取的重组质粒进行小量酶切鉴定。在用特定的限制性内 切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切效果。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 恒温培养箱、恒温摇床、台式离心机、高压灭菌锅、EP 管、水浴锅、离心管、移液器、 吸头、制冰机、琼脂糖凝胶电泳设备、微量移液器（10、100、1000μL 量程各一支）1.5 ml EP 管、PE 手套和乳胶手套。 二、试剂 1. 质粒提取试剂盒（博大泰克） 溶液Ⅰ 溶液Ⅱ 溶液Ⅲ 结合缓冲液 浓缩漂洗液 洗脱缓冲液 离心吸附柱 2. Hind III 限制性内切核酸酶
3.内切酶反应缓冲液 4.琼脂糖凝胶电泳相关试剂 【实验步骤】 1.从实验七转化平板上挑白色的单菌落于2mL含Amp(50μgmL)的LB液体培养基中 37℃振荡(225rpm)培养过夜。 2.取1.5mL培养物至2mL离心管中，12,000rpm离心1min。 3.弃培养液上清，尽可能除去细菌沉淀里残留的液体培养基。 4.将细菌沉淀悬浮于100uL溶液I中，充分混匀(vortex)。 5.加150L溶液Ⅱ，立即颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。 随后将离心管放置冰上1-2min(此步反应时间勿超过5分钟！) 6.加入150uL溶液Ⅲ，立即颠倒离心管数次，将离心管室温放置3-5min。12,000pm离 心12min。 7.将420L结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤3中的上清加入离心吸附柱中（尽 量去除杂质)，混匀，12,000pm离心30s。倒掉废液收集管中的废液。 8.加入750uL漂洗液于离心吸附柱中，静置1min后，12,000pm离心15s。倒掉废液收 集管中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于12,000pm离心2min,尽量除去漂洗液。 9.小心取出离心吸附柱，放入一个千净的1.5 ml Eppendorf离心管中，加入50uL无菌水 至柱子中央，室温放置2-5min后，12,000rpm离心1min。 10.冰浴或-20℃保存。 11.构建重组质粒酶切体系，限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2或0.5 ml PCR薄壁离心 管中进行。 在冰浴上建立酶切反应体系(20uL) ddH2O 16uL 10xBufferR 2uL HindⅢ lpL 重组质粒 1L(本实验提取的重组质粒DNA)
26 3. 内切酶反应缓冲液 4. 琼脂糖凝胶电泳相关试剂 【实验步骤】 1. 从实验七转化平板上挑白色的单菌落于 2 mL 含 Amp ( 50 μg/mL )的 LB 液体培养基中 37 ℃ 振荡（225rpm）培养过夜。 2. 取 1.5 mL 培养物至 2mL 离心管中，12,000rpm 离心 1 min。 3. 弃培养液上清，尽可能除去细菌沉淀里残留的液体培养基。 4. 将细菌沉淀悬浮于 100μL 溶液 I 中，充分混匀（vortex）。 5. 加 150μL 溶液Ⅱ，立即颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮。 随后将离心管放置冰上 1-2min(此步反应时间勿超过５分钟！) 6. 加入 150μL 溶液Ⅲ，立即颠倒离心管数次，将离心管室温放置 3-5 min。12,000rpm 离 心 12min。 7. 将 420μL 结合缓冲液加入离心吸附柱中，然后将步骤 3 中的上清加入离心吸附柱中（尽 量去除杂质），混匀，12,000rpm 离心 30s。倒掉废液收集管中的废液。 8. 加入 750μL 漂洗液于离心吸附柱中，静置 1min 后，12,000rpm 离心 15s。倒掉废液收 集管中的废液。重复一次。倒掉废液后。再次于 12,000rpm 离心 2 min，尽量除去漂洗液。 9. 小心取出离心吸附柱，放入一个干净的 1.5ml Eppendorf 离心管中，加入 50μL 无菌水 至柱子中央，室温放置 2-5min 后，12,000rpm 离心 1 min。 10.冰浴或-20 ℃ 保存。 11. 构建重组质粒酶切体系，限制性内切酶反应一般在灭菌的 0.2 或 0.5ml PCR 薄壁离心 管中进行。 在冰浴上建立酶切反应体系（20μL） ddH2O 16μL 10×Buffer R 2μL HindⅢ 1μL 重组质粒 1μL（本实验提取的重组质粒 DNA）
Total 20μuL 限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸混匀，6000pm离心15s。 12.37℃水浴温育1.5hr。 13.取1L酶切产物，加入1L6×上样缓冲液和4如L1x电泳缓冲液，混匀后凝胶电 泳观察实验结果。 【实验安排】 本实验一天内可做完。 【注意事项】 1.提取的质粒DNA不纯：变性不充分：关键步骤反应时间过短：离心时间或速度不够。 2.提取的质粒DNA呈涂布状：操作过程中用力过猛，动作过大：操作系统内有污染。 3.与染色体DNA分离不全：变性过程不完全：试剂配制有问题（成分，浓度或pH)。 4.限制性内切酶需保存于-20℃，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。 5.限制性内切酶溶液通常含有50%甘油，加入反应管后，因密度较大，往往沉淀至溶液 底部，所以要充分摇匀。 6.加样时吸头垂直进入试剂管，避免碰到管壁，每加完一样要换一个吸头，同时在已加 的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。 7.酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头探入不可过深。 8.酶解消化反应温度及时间根据该酶使用说明书而定。 9.注意酶的用量，加入的酶量按1-3 U/ug DNA计算，爵的体积应低于反应总体积的10%， 以避免酶液中甘油干扰反应。酶量过大（≥25 U/ug DNA)时，有产生所谓星号活性的可能， 即在识别序列以外的位点进行切制。此外，反应体系中甘油的质量分数大于12%，以及缺少 NaCI等情况下，都有可能出现星号活性。 【相关问题】 1.酶的保存 不同的限制酶往往保存在大致相似的缓冲液中，这种特定配方的缓冲液能使酶活性维持 较长时间。常用的保存缓冲液各组分作用如下：
27 Total 20μL 限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸混匀，6000 rpm 离心 15s。 12. 37℃ 水浴温育 1.5hr。 13. 取 1μL 酶切产物，加入 1μL 6×上样缓冲液和 4μL 1x 电泳缓冲液，混匀后凝胶电 泳观察实验结果。 【实验安排】 本实验一天内可做完。 【注意事项】 1. 提取的质粒 DNA 不纯：变性不充分；关键步骤反应时间过短；离心时间或速度不够。 2. 提取的质粒 DNA 呈涂布状：操作过程中用力过猛，动作过大；操作系统内有污染。 3. 与染色体 DNA 分离不全：变性过程不完全；试剂配制有问题（成分，浓度或 pH）。 4. 限制性内切酶需保存于-20℃，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。 5. 限制性内切酶溶液通常含有 50%甘油，加入反应管后，因密度较大，往往沉淀至溶液 底部，所以要充分摇匀。 6. 加样时吸头垂直进入试剂管，避免碰到管壁，每加完一样要换一个吸头，同时在已加 的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。 7. 酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头探入不可过深。 8. 酶解消化反应温度及时间根据该酶使用说明书而定。 9. 注意酶的用量，加入的酶量按 1-3U/μg DNA 计算，酶的体积应低于反应总体积的 10%， 以避免酶液中甘油干扰反应。酶量过大（≥25U/μg DNA）时，有产生所谓星号活性的可能， 即在识别序列以外的位点进行切割。此外，反应体系中甘油的质量分数大于 12%，以及缺少 NaCl 等情况下，都有可能出现星号活性。 【相关问题】 1. 酶的保存 不同的限制酶往往保存在大致相似的缓冲液中，这种特定配方的缓冲液能使酶活性维持 较长时间。常用的保存缓冲液各组分作用如下：