实验一植物基因组DNA的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外 分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 通过CTAB法提取植物基因组DNA是由Murray和Thompson(I98O)修改而成的简便 方法。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强 度下（大于0.7MNC),与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行 研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法 去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电 解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点 的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效 应和分子筛效应。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等 量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，DNA分 子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的 DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质 量的DNA,也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如pUCI9质粒，有 3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA,简称cccDNA), 开环质粒DNA,即环状质粒DNA的I条链断裂，(open circular DNA,简称ocDNA),线状 质粒DNA,即环状质粒DNA的2条链在同一处发生断裂((linear DNA,简称LDNA)。这3 种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒 DNA泳动最快，其次为线状DNA,最慢的为开环质粒DNA。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在26Om波长处有特异的 紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基 础。1OD2o相当于dsDNA50ugmL,ssDNA33ugmL和ssRNA40ugmL。可以此米计算核酸 样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫 外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能 有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染
实验一 植物基因组 DNA 的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用 CTAB 法从植物组织中提取 DNA 并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外 分光光度法对 DNA 进行定性定量分析。 【实验原理】 通过 CTAB 法提取植物基因组 DNA 是由 Murray 和 Thompson (1980) 修改而成的简便 方法。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强 度下(大于 0.7M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行 研磨，从而破碎细胞。然后加入 CTAB 缓冲液将 DNA 溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法 去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到 DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化 DNA 片段的常用技术。把 DNA 样品加入到一块包含电 解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA 分子在高于等电点 的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效 应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等 量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样，DNA 分 子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的 DNA 分子比分子量大的 DNA 分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质 量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子。如 pUC19 质粒，有 3 种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒 DNA(covalently closed circular DNA，简称 cccDNA)， 开环质粒 DNA，即环状质粒 DNA 的 1 条链断裂，(open circular DNA，简称 ocDNA)，线状 质粒 DNA，即环状质粒 DNA 的 2 条链在同一处发生断裂(linear DNA，简称 L DNA）。这 3 种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈 3 条带，超螺旋质粒 DNA 泳动最快，其次为线状 DNA，最慢的为开环质粒 DNA。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在 260nm波长处有特异的 紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基 础。1 OD260相当于dsDNA 50μg/mL，ssDNA 33μg/mL和ssRNA 40μg/mL。可以此来计算核酸 样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定 260nm和 280nm的紫 外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280 比值高于 2.0，则可能 有RNA污染，低于 1.8 则有蛋白质污染
【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系 统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 量程各一支)、胶带、100mL或250mL锥形瓶、量筒、陶瓷研钵、液氨、研磨棒、点样板 或parafilm、吸头、1.5mlEP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(Ts、乙二胺四乙酸EDTA人CTAB(十六烷基三甲基溴化铵、B 巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠NaC、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚 蓝、蔗糖、琼脂糖、溴化乙锭、盐酸。 三、试剂 1.2xCTAB buffer 配50mL 100mM Tris-Cl pH8.0 5mLIM贮存液 1.4M NaCl 17.5mL4M贮存液 20 mM EDTA pH8.0 2mL0.5M贮存液 2%CTAB 需CTAB固体粉末1g 0.2%巯基乙醇 需巯基乙醇100L 2.70%乙醇 3.RNaseA(10mg/mL) 4.0.5xTBE冲液（工作浓府） 45 nM Tris-.硼酸盐 1mM EDTA 配5×TBE(贮存液)1000mL Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5 mol/L EDTA 20 mL (pH 8.0) 5.凝胶加样缓冲液(6×) 溴酚蓝 0.25% 蔗糖 40% 6.溴化乙锭(EB)贮存液10mgml 7.DNA marker 8.0.1×TE 9. 酚/氯仿(11，VN
【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系 统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000μL 量程各一支)、胶带、100 mL 或 250 mL 锥形瓶、量筒、陶瓷研钵、液氮、研磨棒、点样板 或 parafilm、吸头、1.5 ml EP 管、PE 手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA )、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β- 巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA ) 、溴酚 蓝、蔗糖、琼脂糖、溴化乙锭、盐酸。 三、试剂 1. 2×CTAB buffer 配 50mL 100mM Tris-Cl pH8.0 5 mL 1M 贮存液 1.4M NaCl 17.5 mL 4M 贮存液 20 mM EDTA pH8.0 2 mL 0.5M 贮存液 2% CTAB 需 CTAB 固体粉末 1g 0.2%巯基乙醇 需巯基乙醇 100 μL 2. 70%乙醇 3. RNaseA (10mg/mL) 4. 0.5×TBE 缓冲液(工作浓度) 45mM Tris-硼酸盐 1mM EDTA 配 5×TBE (贮存液) 1000 mL Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5 mol/L EDTA 20 mL (pH 8.0) 5. 凝胶加样缓冲液(6×) 溴酚蓝 0.25 % 蔗糖 40 % 6. 溴化乙锭 (EB ) 贮存液 10mg/mL 7. DNA marker 8. 0.1×TE 9. 酚/氯仿 (1:1，V/V)
【实验步骤】 1,取约100mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5mLEP管，在液氨冷冻条件下研磨成粉末状. 2.加入0.6mL2×CTAB提取液（用前加入0.2%的巯基乙醇），混匀，65℃水浴30min, 每10min颠倒混匀一次 3.取出离心管，冷却后加入0.6mL酚氯仿混合液，混匀。 4.13,000rpm室温离心4min(若没离好可重复一次). 5.将上清液转移到另一1.5mL离心管中。 6.加等体积氯仿混匀，13,000pm离心4mim,取上清 7.加入2倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，20℃放置60min。 8.4℃，15,000rpm离心20min. 9.弃上清，70%乙醇洗沉淀2次，风干。 10.加入25L无茵水（含25 ug/mL RNase A,溶解DNA IL.取1 HL DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测： ()制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5.7 1.2 0.4.6 15 02-4 2.0 0.1-3 称取0.3g琼脂糖，放入三角瓶中，加入30mL0.5xTBE缓冲液，置微波炉或水浴加热 至完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。 琼脂糖由D半乳糖和L~半乳糖通过糖苷键交替形成线状聚合物。琼脂糖溶解后链间糖 分子上的羟基由于氢键的作用相互连接，形成三维空间结构，琼脂糖浓度越高，形成的孔隙 越小，分辨能力也越强。琼脂神凝胶的分辨范用一般在02-50kb之间。 (2)胶板的制备 ①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮音或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一 定封严，不能留缝隙)，形成一个模具
【实验步骤】 1. 取约 100mg 新鲜的拟南芥嫩叶放入 1.5mL EP 管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。 2. 加入 0.6 mL 2×CTAB 提取液(用前加入 0.2﹪的巯基乙醇)，混匀，65℃ 水浴 30 min， 每 10 min 颠倒混匀一次。 3. 取出离心管，冷却后加入 0.6 mL 酚氯仿混合液，混匀。 4. 13,000 rpm 室温离心 4 min(若没离好可重复一次)。 5. 将上清液转移到另一 1.5mL 离心管中。 6. 加等体积氯仿混匀，13,000rpm 离心 4 min，取上清。 7. 加入 2 倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置 60 min。 8. 4℃，15,000rpm 离心 20 min。 9. 弃上清，70％乙醇洗沉淀 2 次，风干。 10. 加入 25 μL 无菌水(含 25μg/mL RNase A)，溶解 DNA。 11. 取 1μL DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测： (1) 制备琼脂糖凝胶 按照被分离 DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度/％ 线性 DNA 的有效分离范围／kb 0.3 5 - 60 0.6 1 - 20 0.7 0.8 - 10 0.9 0.5 - 7 1.2 0.4 - 6 1.5 0.2 - 4 2.0 0.1 - 3 称取 0.3g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入 30mL0.5×TBE 缓冲液，置微波炉或水浴加热 至完全溶化，取出摇匀，则为 1％琼脂糖凝胶液。 琼脂糖由 D-半乳糖和 L-半乳糖通过糖苷键交替形成线状聚合物。琼脂糖溶解后链间糖 分子上的羟基由于氢键的作用相互连接，形成三维空间结构，琼脂糖浓度越高，形成的孔隙 越小，分辨能力也越强。琼脂糖凝胶的分辨范围一般在 0.2-50kb 之间。 (2) 胶板的制备 ① 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一 定封严，不能留缝隙），形成一个模具
②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 ③将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上 形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 ④室温下静置直至凝胶完全凝周（室温下30-45m),垂直轻拔梳子，取下胶带，将 凝胶及内槽放入电泳槽中。 ⑤加电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1mm。 )加样 在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不 小于I×。用IOuL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNA marker分别加至 样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏 样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 上样缓冲液有三个作用：增加样品的密度以保证DNA沉入加样孔内：使样品带有颜色 便于简化上样过程：其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝是带电 荷的小分子化合物，呈蓝紫色，是一种凝胶的示踪染料，迁移速率相当于300p的线性双链 DNA分子，通过观察溴酚蓝的迁移位置，可估计样品中DNA分子的迁移位置 (④电泳 ①接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移 动)。DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此 最高电压不超过5Vcm。 ②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 ⑤)染色 将电泳后的凝胶浸入含有0.5gmL溴化乙锭的电泳缓冲液中，染色（室温30-45mim) 清水脱色10mi,紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照 保存。 溴化乙锭(Ethidium bromide,EB),是一种扁平的分子，能嵌入核酸分子相邻的碱基之 间，可以和DNA形成络合物，并在约30Onm波长的紫外光下发射出桔红色荧光，使DNA 分子在凝胶中便于鉴定。 12.紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度： (1)用0.1×TE对待测DNA样品按120或合适的倍数稀释。 (2)开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready 时，进入核酸测定窗口
② 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 ③ 将冷却到 60℃ 左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上 形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 ④ 室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下 30-45 min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将 凝胶及内槽放入电泳槽中。 ⑤ 加电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约 1mm。 (3) 加样 在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不 小于 1×。用 10μL 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将 DNA marker 分别加至 样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏 样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 上样缓冲液有三个作用：增加样品的密度以保证 DNA 沉入加样孔内；使样品带有颜色 便于简化上样过程；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝是带电 荷的小分子化合物，呈蓝紫色，是一种凝胶的示踪染料，迁移速率相当于 300bp 的线性双链 DNA 分子，通过观察溴酚蓝的迁移位置，可估计样品中 DNA 分子的迁移位置。 (4) 电泳 ① 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA 片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移 动）。DNA 的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此， 最高电压不超过 5V/cm。 ② 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1-2cm 处，停止电泳。 (5) 染色 将电泳后的凝胶浸入含有 0.5 μg/mL 溴化乙锭的电泳缓冲液中，染色（室温 30-45min）， 清水脱色 10min，紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照 保存。 溴化乙锭（Ethidium bromide, EB），是一种扁平的分子，能嵌入核酸分子相邻的碱基之 间，可以和 DNA 形成络合物，并在约 300nm 波长的紫外光下发射出桔红色荧光，使 DNA 分子在凝胶中便于鉴定。 12.紫外分光光度法测定 DNA 浓度及纯度： (1) 用 0.1×TE 对待测 DNA 样品按 1:20 或合适的倍数稀释。 (2) 开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready” 时，进入核酸测定窗口
(3)调零。先用0.1xTE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“str心键， 仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。 (4)吸7OL已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很 少，可以用5~TuL的石英样品杯。点击“eter”键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示 260和280nm处的光密度(OD值)及A260/A280nm和A280/A260nm的比率以及DNA样 品的浓度等。 (⑤)打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加 入下一个待测样品 (6)DNA纯度：以A260/A280比值米反映。当A260A280比值<1.8时，说明样品存在 蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除 残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE溶解后再测定。当A260/A280比值>2.0，说明样品存在RNA 污染，可以用RNA酶处理样品去除RNA。 【实验结果】 在紫外灯(360nm,312nm或254nm）下观察染色后的电泳凝胶（图1-1）。DNA存 在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应藏上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作 用)。 图1】拟南芥基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果 【实验安排】 本实验一天内可完成：上午提DNA,下午电泳及紫外分光光度法检测DNA
(3) 调零。先用 0.1×TE 缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键， 仪器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。 (4) 吸 70μL 已稀释的 DNA 样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很 少，可以用 5～7μL 的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示 260 和 280nm 处的光密度（OD 值）及 A260/A280nm 和 A280/A260nm 的比率以及 DNA 样 品的浓度等。 (5) 打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加 入下一个待测样品。 (6) DNA 纯度：以 A260/ A280 比值来反映。当 A260 /A280 比值<1.8 时，说明样品存在 蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除 残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE 溶解后再测定。当 A260/A280 比值>2.0，说明样品存在 RNA 污染，可以用 RNA 酶处理样品去除 RNA。 【实验结果】 在紫外灯（360 nm, 312 nm 或 254 nm ）下观察染色后的电泳凝胶（图 1-1）。DNA 存 在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作 用）。 图 1-1 拟南芥基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果 【实验安排】 本实验一天内可完成：上午提 DNA，下午电泳及紫外分光光度法检测 DNA