《基因工程原理》教案 (二0一二年修订稿) 安徽大学生命科学学院 1
1 《基因工程原理》教案 （二 O 一二年修订稿） 安徽大学生命科学学院
第一章绪论 重点：基因工程的概念和内容，基因工程技术在现代生物技术中的地位和作用。 难点：基因工程与遗传工程的区别。 (一)前言 生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等4个部分。 (二)什么是基铟、基因工程 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能 力的DNA分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含 有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子拷贝或其 表达产物。 (三)基因工程的主要内容 ■目的基因的制备 ■载体的选择和制备 ■DNA分子的体外连接 ■将外源DNA导入宿主细胞 ■目的基因的筛选和鉴定 (四)基因工程的历史及我国开展基因工程的现状 第二章基因工程的基本操作技术 重点：PCR技术和基因定点诱变技术。包，括PCR技术的原理，反向PCR与染色体 步移，不对称PCR与DNA序列测定，PCR与RAPD,RT-PCR与RNA分析；基 因定点诱变的原理，盒式诱变，寡核苷酸引物诱变和PC诱变。 2
2 第一章 绪论 重点：基因工程的概念和内容，基因工程技术在现代生物技术中的地位和作用。 难点：基因工程与遗传工程的区别。 （一）前言 生物工程主要有基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等 4 个部分。 （二）什么是基因、基因工程 应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体 DNA 结合成一具有自我复制能 力的 DNA 分子（复制子、重组体），继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含 有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一 DNA 分子拷贝或其 表达产物。 （三）基因工程的主要内容 ◼ 目的基因的制备 ◼ 载体的选择和制备 ◼ DNA 分子的体外连接 ◼ 将外源 DNA 导入宿主细胞 ◼ 目的基因的筛选和鉴定 （四）基因工程的历史及我国开展基因工程的现状 第二章 基因工程的基本操作技术 重点：PCR 技术和基因定点诱变技术。包括 PCR 技术的原理，反向 PCR 与染色体 步移，不对称 PCR 与 DNA 序列测定，PCR 与 RAPD，RT-PCR 与 RNA 分析；基 因定点诱变的原理，盒式诱变，寡核苷酸引物诱变和 PCR 诱变
难点：酶学测序的原理和程序，基因化学合成的原理和程序 (一)凝胶电泳技术 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以DNA和RNA实际 上呈多聚阴离子状态(Polyanions,将DNA、RNA放到电场中，它就会由负极 一正极移动。 >琼脂糖凝胶电泳 >聚丙烯酰胺凝胶电泳 >脉冲场凝胶电泳 RNA电泳 (二)细菌转化技术 ·转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一 种基因型细胞的DNA,进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现 象。 ·提供转化DNA的菌株叫做供体菌株，而接受转化DNA的寄主菌株则称做 受体菌株。 常见转化方法有原生质体转化法；化学转化法；电穿孔法 （三)核酸杂交技术 ·所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA,当它 们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 ·Southern blot;Northern blotting;斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落原 位杂交 注意比较 3
3 难点：酶学测序的原理和程序，基因化学合成的原理和程序。 （一）凝胶电泳技术 在生理条件下，核酸分子中的磷酸基团是离子化的，所以 DNA 和 RNA 实际 上呈多聚阴离子状态（Polyanions）。将 DNA、RNA 放到电场中，它就会由负极 →正极移动。 ➢ 琼脂糖凝胶电泳 ➢ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ➢ 脉冲场凝胶电泳 ➢ RNA 电泳 （二）细菌转化技术 ▪ 转化作用就是一种基因型细胞（感受态细菌）从周围介质中吸收来自另一 种基因型细胞的 DNA, 进而使原来细胞的遗传基因和遗传性发生相应变化的现 象。 ▪ 提供转化 DNA 的菌株叫做供体菌株，而接受转化 DNA 的寄主菌株则称做 受体菌株。 常见转化方法有原生质体转化法；化学转化法； 电穿孔法 （三）核酸杂交技术 ▪ 所依据的原理是，带有互补的特定核苷酸序列的单链 DNA 或 RNA，当它 们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。 ▪ Southern blot；Northern blotting；斑点印迹杂交和狭线印迹杂交；菌落原 位杂交 注意比较
核酸分子杂交法的技术路线比较 菌落原位杂交 赛点杂交Southern印迹Northern印述 菌落或赠菌斑转印拉提DNA/RNA提取DN 提取RN “到陕上 裂解细菌或噬离疼变性核玻样品 球脂糖颜胶电泳 变性DN将楼酸点加到膜上 生胎装 将枝酸固定在膜上一预染交（消除非特异吸附位点）一加入 核素标记探针进行杂交 异结合探针)一 放射自显彩减显色反应示踪 (四)DNA测序分析 ·DNA链末端合成终止法：DNA聚合酶能够用单链DNA作为模板，合成准 确的DNA互补链；②该酶能够用2'，3'-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合 到新生寡核苷酸链的3'末端，从而终止其延伸反应。在DNA测序反应中，加 入模板DNA,引物（特异性引物，如T7,T3,M13等），DNA聚合酶，dA,dT, dG,dC和一种ddNTP。常用Klenow大片段，无5'→3'外切酶活性. ·Maxam-Gilbert化学修饰法（哈佛大学）：该方法的基本原理是用化学试剂 处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具 有不同长度的DNA链降解产物，经凝胶电泳分离和放谢自显影之后，可直接 读出待测DNA片段的核苷酸序列。 DNA杂交测序法SBH-Sequencing by hybridization):如果一段较短的DNA 探针能与较长的DNA片段杂交并形成完全的双链结构我们就推测在靶DNA 上存在着相应的互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。用一组已知 4
4 （四）DNA 序列分析技术 （四）DNA 测序分析 ▪ DNA 链末端合成终止法：DNA 聚合酶能够用单链 DNA 作为模板，合成准 确的 DNA 互补链；② 该酶能够用 2'，3'-双脱氧核苷三磷酸作底物并将其聚合 到新生寡核苷酸链的 3'-末端，从而终止其延伸反应。在 DNA 测序反应中，加 入模板 DNA，引物（特异性引物，如 T7，T3，M13 等），DNA 聚合酶，dA，dT， dG，dC 和一种 ddNTP。常用 Klenow 大片段，无 5'→3'外切酶活性。 ▪Maxam-Gilbert 化学修饰法(哈佛大学)：该方法的基本原理是用化学试剂 处理具有末端放射性标记的 DNA 片段，造成碱基的特异性切割并产生一组具 有不同长度的 DNA 链降解产物，经凝胶电泳分离和放射自显影之后，可直接 读出待测 DNA 片段的核苷酸序列。 ▪DNA 杂交测序法(SBH-Sequencing by hybridization)：如果一段较短的 DNA 探针能与较长的 DNA 片段杂交，并形成完全的双链结构，我们就推测在靶 DNA 上存在着相应的互补序列，这就是 DNA 杂交测序法的基本原理。用一组已知 核酸分子杂交法的技术路线比较 菌落原位杂交 菌落或噬菌斑转印 到膜上 抽提DNA/RNA 提取DNA 提取RNA 裂解细菌或噬菌斑 变性核酸样品 琼脂糖凝胶电泳 变性DNA 将核酸点加到膜上 将凝胶上核酸条带转移到膜 上，同时变性 将核酸固定在膜上→预杂交（消除非特异吸附位点）→加入 核素标记探针进行杂交→漂洗膜（洗去非特异结合探针）→ 放射自显影或显色反应示踪 斑点杂交 Southern印迹 Northern印迹
系列的寡核苷酸短序列做为探针，同某一较长的靶DNA分子杂交，从而测定 其序列。 (五)基因的化学合成 (六)PCR技术 ·PCR反应体系的设立 ·PCR反应程序设计 ·引物设计原理 ·PCR技术应用 (七)基因定点诱变技术 使已克隆基因或DNA片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变 化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段 ·盒式诱变(cassette mutagenesis)包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两 种方式 ·寡核苷酸引物诱变应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做3引物 进行DNA复制，使寡核苷酸引物成为新合成的DNA子链的一个部分 ·PCR诱变：重组PCR定点诱变、大引物诱变 (八)DNA与蛋白质相互作用 ·凝胶阳滞实验elretardation assay)又称DNA迁移率变化试验DNA mobility shift assay, DMSA):DNA与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断DNA是否与蛋白质 发生结合 ·DNasel印迹试验(DNasel foot printing)用于检测与蛋白结合的DNA序列的部位及特 5
5 系列的寡核苷酸短序列做为探针，同某一较长的靶 DNA 分子杂交，从而测定 其序列。 （五）基因的化学合成 （六）PCR 技术 ▪ PCR 反应体系的设立 ▪ PCR 反应程序设计 ▪ 引物设计原理 ▪ PCR 技术应用 （七）基因定点诱变技术 使已克隆基因或 DNA 片段中的任何一个特定碱基发生取代、插入或缺失变 化的过程叫作基因的定点诱变，是基因工程和蛋白质工程的重要手段。 ▪ 盒式诱变（cassette mutagenesis）包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两 种方式。 ▪ 寡核苷酸引物诱变 应用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸短片段做引物， 进行 DNA 复制，使寡核苷酸引物成为新合成的 DNA 子链的一个部分 ▪ PCR 诱变：重组 PCR 定点诱变、大引物诱变 （八）DNA 与蛋白质相互作用 ▪ 凝胶阻滞实验（Gel retardation assay），又称DNA迁移率变化试验（DNA mobility shift assay， DMSA）：DNA 与蛋白质结合后分子量变大，改变了迁移率，由此判断 DNA 是否与蛋白质 发生结合 ▪ DNaseI 印迹试验（DNaseI foot printing） 用于检测与蛋白结合的 DNA 序列的部位及特