前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。 3.Tq聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可 过深，酶量不能过多。 4.胶回收时，配凝胶的三角瓶、电泳槽和配胶板要先冲洗干净，电泳时用新配制的电泳 缓冲液。 【影响PCR的主要因素】 1.模板DNA 单链、双链DNA均可作为PCR的模板，DNA样品尽量纯净，不能有核酸酶、蛋白水解酶 等的污染。模板用量依具体实验而定，一般为100L反应液有10-10个目标分子。PCR反应 时模板变性要充分。 2.PCR引物 PCR引物设计是否成功是能否获得高质量PCR产物最关键的因素之一。在设计和应用 时，需注意以下重要环节： (1)PC℉引物的长度约为18~30个核苷酸，并且成对引物间的G+C含量应相似。以使 它们在相近的温度下与其互补序列结合。G+C含量应为45%~55%之间。碱基分布是随机的， 应避免连续出现4个以上的单一碱基，尤其是不应在其3”端出现3个连续G或C,否则会使 引物在G+C富集序列区错误引发。引物3”端碱基最好选用A、G、C,尽可能地避免选用T, 尤其应避免连续出现2个以上T。 (2)一般来说，PCR产物<500bp时，引物长度选择16-18bp:PCR产物25kb时，引物长 度选择24bp左右为宜。 (3)要避免引物分子自身序列互补，否则会形成发夹样二级结构。两个PC℉引物相互之 间的3'末端序列不能有明显的互补性，以免形成引物二聚体。 (4)引物的熔解温度(Tm值)要适当。Tm值与引物的碱基组成和长度有关：PC℉引物 的GC/AT应与要扩增的模板DNA相当或略高些。一般熔解温度以大于55℃为宜。 (⑤)引物的3”末端必须与模板严格互补，而5”末端的要求可灵活些。 (6)目前在引物选择中已广泛应用计算机软件，从EMBL或Genebank中查找有关基因序
13 前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。 3. Taq 聚合酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可 过深，酶量不能过多。 4. 胶回收时，配凝胶的三角瓶、电泳槽和配胶板要先冲洗干净，电泳时用新配制的电泳 缓冲液。 【影响 PCR 的主要因素】 1. 模板 DNA 单链、双链DNA均可作为PCR的模板，DNA样品尽量纯净，不能有核酸酶、蛋白水解酶 等的污染。模板用量依具体实验而定，一般为 100μL反应液有 105 -106 个目标分子。PCR反应 时模板变性要充分。 2. PCR 引物 PCR 引物设计是否成功是能否获得高质量 PCR 产物最关键的因素之一。在设计和应用 时，需注意以下重要环节： (1) PCR 引物的长度约为 18～30 个核苷酸，并且成对引物间的 G＋C 含量应相似。以使 它们在相近的温度下与其互补序列结合。G+C 含量应为 45%～55%之间。碱基分布是随机的， 应避免连续出现 4 个以上的单一碱基，尤其是不应在其 3’端出现 3 个连续 G 或 C，否则会使 引物在 G+C 富集序列区错误引发。引物 3’端碱基最好选用 A、G、C，尽可能地避免选用 T， 尤其应避免连续出现 2 个以上 T。 (2) 一般来说，PCR 产物≤500bp 时，引物长度选择 16-18bp；PCR 产物≥5kb 时，引物长 度选择 24bp 左右为宜。 (3) 要避免引物分子自身序列互补，否则会形成发夹样二级结构。两个 PCR 引物相互之 间的 3’末端序列不能有明显的互补性，以免形成引物二聚体。 (4) 引物的熔解温度（Tm 值）要适当。Tm 值与引物的碱基组成和长度有关；PCR 引物 的 GC/AT 应与要扩增的模板 DNA 相当或略高些。一般熔解温度以大于 55℃为宜。 (5) 引物的 3’ 末端必须与模板严格互补，而 5’ 末端的要求可灵活些。 (6) 目前在引物选择中已广泛应用计算机软件，从 EMBL 或 Genebank 中查找有关基因序
列，并对设计的引物在引物二聚体形成、自身互补性及特异性等方面进行分析评价。 (⑦)用于亚克隆的引物，常在引物的5”端加上限制性内切酶位点。为了保证内切酶有效 酶切扩增产物，一般在酶切位点的5端再加上几个额外的保护碱基。 (8)引物的浓度，在终浓度为0.2~1.0 umol/L的范围内产量基本相同，低于0.2 umol/L时 会影响产量。但过高时一则不经济，二则会出现非特异扩增及增加引物二聚体的产生。 3.热稳定DNA聚合酶（如Tag DNA聚合酶） 一般用量为2.5U100L反应体积。酶量过多易导致非特异性产物的产生。该类酶的最 适温度为75℃，在低温下仍保留相当高的活性，易引起不完全配对的引物-模板的非特异延 伸及引物二聚体的扩增延伸，所以应注意防止非特异性产物的出现。 4.dNTPs PCR常用的dNTP浓度在50-20OμmolL.四种dNTPs应等浓度.浓度低则反应速度下降， 过高则特异性下降，可根据具体实验来确定最适的dNTP浓度。 5.PCR缓冲液 因PCR反应中的NTP能与Mg结合，影响反应液中游离Mg+的浓度，所以应按不同条 件，确定合适的Mg2浓度。一般在标准的PCR反应中(dNTP浓度200 umol/L),Mg2+浓度约 为1.5 mmol/L。Mg+离子浓度可显著影响PCR的产量及产物特异性。浓度高则出现非特异扩 增，过低则酶活性显著下降。应用无核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%~0.1%)及5mmol的二硫 苏糖醇(DTT)对酶有一定的保护作用。 6.PCR循环的温度 预变性：起始变性的时间应该长些，以使变性充分。一般为94℃3-5min。变性不完全时， DNA双链会很快复性，影响PCR反应，但若变性温度太高（不宜超过95℃），会影响Tq 酶的活性。 变性：一般为94℃30s或95℃20s。 引物退火：应根据具体反应中引物与模板的碱基配对情况及实验的目的确定。一般为 50-72℃。退火温度增高会增强对不正确退火引物的识别，还能降低引物3'端不正确核苷酸的 错误延伸。 14
14 列，并对设计的引物在引物二聚体形成、自身互补性及特异性等方面进行分析评价。 (7) 用于亚克隆的引物，常在引物的 5’ 端加上限制性内切酶位点。为了保证内切酶有效 酶切扩增产物，一般在酶切位点的 5’端再加上几个额外的保护碱基。 (8) 引物的浓度，在终浓度为 0.2～1.0μmol/L 的范围内产量基本相同，低于 0.2 μmol/L 时 会影响产量。但过高时一则不经济，二则会出现非特异扩增及增加引物二聚体的产生。 3. 热稳定 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶） 一般用量为 2.5 U/100μL 反应体积。酶量过多易导致非特异性产物的产生。该类酶的最 适温度为 75℃，在低温下仍保留相当高的活性，易引起不完全配对的引物-模板的非特异延 伸及引物二聚体的扩增延伸，所以应注意防止非特异性产物的出现。 4. dNTPs PCR 常用的 dNTP 浓度在 50-200μmol/L。四种 dNTPs 应等浓度。浓度低则反应速度下降， 过高则特异性下降，可根据具体实验来确定最适的 dNTP 浓度。 5. PCR 缓冲液 因PCR反应中的dNTP能与Mg2+结合，影响反应液中游离Mg2+的浓度，所以应按不同条 件，确定合适的Mg2+浓度。一般在标准的PCR反应中（dNTP浓度 200μmol/L），Mg2+浓度约 为 1.5mmol/L。Mg2+离子浓度可显著影响PCR的产量及产物特异性。浓度高则出现非特异扩 增，过低则酶活性显著下降。应用无核酸酶的BSA、Tween-20(0.05%～0.1%)及 5mmol的二硫 苏糖醇（DTT）对酶有一定的保护作用。 6. PCR 循环的温度 预变性：起始变性的时间应该长些，以使变性充分。一般为 94℃ 3-5min。变性不完全时， DNA 双链会很快复性，影响 PCR 反应，但若变性温度太高（不宜超过 95℃），会影响 Taq 酶的活性。 变性：一般为 94℃ 30s 或 95℃ 20s。 引物退火：应根据具体反应中引物与模板的碱基配对情况及实验的目的确定。一般为 50-72℃。退火温度增高会增强对不正确退火引物的识别，还能降低引物 3’端不正确核苷酸的 错误延伸
延伸：一般为72℃60-90s。最后一个循环后应在72℃保留5min,以保证PCR产物合成 的完整性。 7.平台效应和PCR循环的次数 在PC℉基因扩增的后期，由于产物的堆积，将使原来产物以指数增加的速度变为平坦曲 线，即所谓“平台效应”。它的出现是由于PC℉原料的不断消耗、酶的稳定性的降低、终产 物的阻滞效应及非特异性产物等多种因素造成的，所以选择合理的循环次数，既能得到足够 量的PCR产物，又避免无意义地增加循环次数。 8.操作环境 避免环境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目标DNA的污染等。 【复习思考题】 1.怎样保证PCR扩增的特异性和产率？ 2.如何设计PCR引物？ 3.在PCR引物中引入酶切位点时应注意什么？ 4.PCR扩增体系中为什么要有镁离子？ 5.PCR扩增的的基本条件及如何优化PCR扩增的条件？ 6.PCR每一循环有哪几个步骤组成？ 7.影响PCR扩增的因素有哪些？ 8.优化哪些条件可以最大限度的减少非特异性扩增？ 9.DNA纯化回收时为什么要用低熔点琼脂糖凝胶？ 1O.通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化DNA有什么优点？ 11.为什么在DNA的琼脂糖凝胶电泳分离纯化中，特别强调配凝胶的三角瓶、电泳槽和 配胶板要先冲洗干净，电泳时用新配制的电泳缓冲液？ 实验三目的片段和载体的连接 【实验目的】 通过本实验掌握DNA重组连接方法。 【实验原理】 5
15 延伸：一般为 72℃ 60-90s。最后一个循环后应在 72℃保留 5min，以保证 PCR 产物合成 的完整性。 7. 平台效应和 PCR 循环的次数 在 PCR 基因扩增的后期，由于产物的堆积，将使原来产物以指数增加的速度变为平坦曲 线，即所谓“平台效应”。它的出现是由于 PCR 原料的不断消耗、酶的稳定性的降低、终产 物的阻滞效应及非特异性产物等多种因素造成的，所以选择合理的循环次数，既能得到足够 量的 PCR 产物，又避免无意义地增加循环次数。 8. 操作环境 避免环境污染和交叉污染，如核酸酶的污染、非目标 DNA 的污染等。 【复习思考题】 1. 怎样保证 PCR 扩增的特异性和产率？ 2. 如何设计 PCR 引物？ 3. 在 PCR 引物中引入酶切位点时应注意什么？ 4. PCR 扩增体系中为什么要有镁离子？ 5. PCR 扩增的的基本条件及如何优化 PCR 扩增的条件？ 6. PCR 每一循环有哪几个步骤组成？ 7. 影响 PCR 扩增的因素有哪些？ 8. 优化哪些条件可以最大限度的减少非特异性扩增？ 9. DNA 纯化回收时为什么要用低熔点琼脂糖凝胶？ 10. 通过琼脂糖凝胶电泳分离纯化 DNA 有什么优点？ 11. 为什么在 DNA 的琼脂糖凝胶电泳分离纯化中，特别强调配凝胶的三角瓶、电泳槽和 配胶板要先冲洗干净，电泳时用新配制的电泳缓冲液？ 实验三 目的片段和载体的连接 【实验目的】 通过本实验掌握 DNA 重组连接方法。 【实验原理】
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子。DNA 在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。即在一定 的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5'端磷酸和3'端羟基之间相互作用，形 成磷酸二酯键的过程。常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA 连接酶。其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应 用更广泛。 T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分3步：①首先，ATP与T4噬菌体DNA连 接酶通过ATP的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶-AMP复合物。②被激活的AMP随后 从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5端的磷酸基团上，形成磷酸一磷酸键。③DNA链3 端的羟基取代AMP后与DNA5'端的磷酸根形成磷酸二酯键，并释放出AMP,完成DNA之 间的连接。T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条 件下进行连接反应。 连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键 结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-6h(过夜)，这样 既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 本实验将Taq DNA聚合酶的PCR扩增产物(3'端有突出A)与3'端有突出T的线性载 体(pCFT载体)直接进行重组连接。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 移液器、吸头、恒温水浴锅、EP管、微量移液器(10、100、1000uL量程各一支)、吸 头、1.5mlEP管、PE手套和乳胶手套、制冰机。 二、药品及试剂 L.pCF-T连接试剂盒（含pCF-T载体、连接试剂） 2.PCR扩增回收片段 【实验步骤】 L.在灭菌的Eppendorf管中，加入： 6
16 外源 DNA 与载体分子的连接就是 DNA 重组，这种重新组合的 DNA 叫做重组子。DNA 在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程。即在一定 的条件下，DNA 连接酶催化两个双链 DNA 片段的 5’ 端磷酸和 3’ 端羟基之间相互作用，形 成磷酸二酯键的过程。常用的 DNA 连接酶有两种：T4 噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌 DNA 连接酶。其中 T4 噬菌体 DNA 连接酶对底物的要求低，能更有效地连接 DNA 的平末端，应 用更广泛。 T4 噬菌体 DNA 连接酶催化 DNA 连接反应分 3 步：①首先，ATP 与 T4 噬菌体 DNA 连 接酶通过 ATP 的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶-AMP 复合物。②被激活的 AMP 随后 从赖氨酸残基转移到 DNA 一条链的 5’端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键。③DNA 链 3’ 端的羟基取代 AMP 后与 DNA5’端的磷酸根形成磷酸二酯键，并释放出 AMP，完成 DNA 之 间的连接。T4 噬菌体 DNA 连接酶需要镁离子和 ATP 作为辅助因子，在一定的温度和 pH 条 件下进行连接反应。 连接反应的温度在 37℃ 时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键 结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即 12-16 ℃ ，连接 12-l6h（过夜），这样 既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。 本实验将 Taq DNA 聚合酶的 PCR 扩增产物（3’端有突出 A）与 3’端有突出 T 的线性载 体（pCF-T 载体）直接进行重组连接。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 移液器、吸头、恒温水浴锅、EP 管、微量移液器（10、100、1000μL 量程各一支）、吸 头、1.5 ml EP 管、PE 手套和乳胶手套、制冰机。 二、药品及试剂 1. pCF-T 连接试剂盒（含 pCF-T 载体、连接试剂） 2. PCR 扩增回收片段。 【实验步骤】 1. 在灭菌的 Eppendorf 管中，加入：
灭菌水 2.5uL pCFT载体 0.5uL 目的PCR片段 2.0ul Ligase Mix luL 共6uL体系，混匀，16℃连接过夜(12~16h)或室温(20-25℃)连接10min。 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3-I0倍。 2.盖好盖子，用手指轻弹E印管数次，并于台式离心机离心2sc以集中溶液。 3.将反应管放入16℃连接过夜(12~16h) 4.取出约2Sg的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定连接结果，以未经连接的质粒 DNA片段和PCR片段为对照进行电泳检测。 【实验安排】 本实验约需要一天。 【注意事项】 1.连接产物经鉴定后应迅速做转化实验。 2.根据具体情况调节酶的用量。平端连接或接头连接都比黏端连接慢得多，而且酶的用 量也增大。 3.单价阳离子或低浓度的聚乙二醇可提高平端连接的效率。 4.正确调整载体DNA和外源DNA之间的比例有助于获得高产量的重组产物。 【连接反应的影响因素】 1.连接温度与时间的影响 因为黏性末端的D八A双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢健不稳定，但连接酶 的最适温度又恰为37℃。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为 16℃，时间为416h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20℃30min就足以取得相 当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20℃60min能使连接反应进行得更完全一些。对 于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。 2.酶浓度的影响
17 灭菌水 2.5μL pCF-T 载体 0.5μL 目的 PCR 片段 2.0μL Ligase Mix 1μL 共 6μL 体系，混匀，16℃连接过夜（12～16h）或室温（20-25℃）连接 10min。 DNA 片段的摩尔数应控制在载体 DNA 摩尔数的 3-10 倍。 2. 盖好盖子，用手指轻弹 EP 管数次，并于台式离心机离心 2 sec 以集中溶液。 3. 将反应管放入 16℃连接过夜（12～16h）。 4. 取出约 25ng 的 DNA 连接液进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定连接结果，以未经连接的质粒 DNA 片段和 PCR 片段为对照进行电泳检测。 【实验安排】 本实验约需要一天。 【注意事项】 1. 连接产物经鉴定后应迅速做转化实验。 2. 根据具体情况调节酶的用量。平端连接或接头连接都比黏端连接慢得多，而且酶的用 量也增大。 3. 单价阳离子或低浓度的聚乙二醇可提高平端连接的效率。 4. 正确调整载体 DNA 和外源 DNA 之间的比例有助于获得高产量的重组产物。 【连接反应的影响因素】 1. 连接温度与时间的影响 因为黏性末端的 DNA 双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶 的最适温度又恰为 37℃。为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为 16℃，时间为 4-16h。现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20℃ 30min 就足以取得相 当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20℃ 60min 能使连接反应进行得更完全一些。对 于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥。 2. 酶浓度的影响