内蒙古农业大学自编教材 分子生物学实验技术指导 刘惠荣主编 内蒙古农业大学生物工程学院 二OO七年一月
内蒙古农业大学自编教材 分子生物学实验技术指导 刘惠荣 主编 内蒙古农业大学生物工程学院 二○○七年一月
前言 二十一世纪的今天，分子生物学技术已不再神秘，它的理论和技术已经渗入生物学的各 个分支学科及医药农林的各个分支领域，并衍生出了许多新兴的交叉学科，如分子免疫学、 分子微生物学、分子遗传学、分子药理学等，对分子生物学实验技术的掌握已经成为这些学 科在新的高度和深度揭示生命奥秘的共同需求。 实验教学是高校教学工作中一个重要的组成部分，是培养学生实践能力和创新能力的重 要环节，也是提高学生专业素养和就业竞争力的重要途径。本书是在我们多年用作内蒙古农 业大学生物工程学院生物科学专业本科生实验指导讲义的基础上，经修订和改编而成的，可 以作为我校生物和农林等专业的分子生物学实验指导用书。 本书以基本的分子生物学实验为主，内容包括植物基因组DN人提取及其定性定量分析、 PC℉扩增目的片段和胶回收、目的片段和载体的连接、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组质 粒的转化、质粒DNA的提取及酶切鉴定等六个大实验，每个实验都介绍了实验的基本原理、 实验所需仪器试剂、实验操作步骤、注意事项等，为了大家能更好地掌握和理解实验原理及 关键操作，在每个实验后面罗列了与本实验相关的复习题。本书的编写宗台是简明、实用， 是一本适合任何具有分子生物学基本知识的学校本科生、研究生或单位工作人员使用的教 材。 本书是我们内蒙古农业大学生物工程学院几位老师从教学和科研中不断总结经验而完 成的，几位老师为本书的编写投入了大量精力，在此表示感谢。 由于编写本教材的时间仓促，编者水平有限，书中难免出现疏漏之处，希望读者在使用 的过程中，对书中的不当之处提出批评指正，不胜感激。 编者 2007年1月
前 言 二十一世纪的今天，分子生物学技术已不再神秘，它的理论和技术已经渗入生物学的各 个分支学科及医药农林的各个分支领域，并衍生出了许多新兴的交叉学科，如分子免疫学、 分子微生物学、分子遗传学、分子药理学等，对分子生物学实验技术的掌握已经成为这些学 科在新的高度和深度揭示生命奥秘的共同需求。 实验教学是高校教学工作中一个重要的组成部分，是培养学生实践能力和创新能力的重 要环节，也是提高学生专业素养和就业竞争力的重要途径。本书是在我们多年用作内蒙古农 业大学生物工程学院生物科学专业本科生实验指导讲义的基础上，经修订和改编而成的，可 以作为我校生物和农林等专业的分子生物学实验指导用书。 本书以基本的分子生物学实验为主，内容包括植物基因组 DNA 提取及其定性定量分析、 PCR 扩增目的片段和胶回收、目的片段和载体的连接、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组质 粒的转化、质粒 DNA 的提取及酶切鉴定等六个大实验，每个实验都介绍了实验的基本原理、 实验所需仪器试剂、实验操作步骤、注意事项等，为了大家能更好地掌握和理解实验原理及 关键操作，在每个实验后面罗列了与本实验相关的复习题。本书的编写宗旨是简明、实用， 是一本适合任何具有分子生物学基本知识的学校本科生、研究生或单位工作人员使用的教 材。 本书是我们内蒙古农业大学生物工程学院几位老师从教学和科研中不断总结经验而完 成的，几位老师为本书的编写投入了大量精力，在此表示感谢。 由于编写本教材的时间仓促，编者水平有限，书中难免出现疏漏之处，希望读者在使用 的过程中，对书中的不当之处提出批评指正，不胜感激。 编者 2007 年 1 月
目录 实验一植物基因组DNA的提取及其定性定量分析.1 实验二PCR扩增目的片段和胶回收 8 实验三目的片段和载体的连接 15 实验四大肠杆菌感受态细胞的制备和转化效率检测。 实验五重组质粒的转化. 20 实验六重组质粒DNA的提取及酶切鉴定 33 实验七RNA的提取(TRIzol法) 实验八mRNA的分离与纯化 .36 实验九RT-PCR技术 实验十用mRNA差异显示法分离特异表达的基因片段 .40 实验十一cDNA文库的构建 .46 实验十二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) .51 实验十三Southern印迹杂交法(Southern blot). .56 实验十四RNA分子杂交(Northern blot) 62 实验十五固定化蛋白质的免疫生化鉴定(Western blot) 67 实验十六RFLP技术. 71 实验十七RAPD技术 .74 实验十八细胞分裂中期染色体的荧光原位杂交技术(ISH田. 16 附录一常用缓冲液及其配制 .80 附录二常用抗生素溶液 .85 附录三常用贮存液的配制。 85 附录四常用核酸蛋白换算数据 附录五染料在凝胶中的迁移速度. .94 附录六实验中的一些好习惯 .95
目 录 实验一 植物基因组DNA的提取及其定性定量分析. 1 实验二 PCR扩增目的片段和胶回收. 8 实验三 目的片段和载体的连接. 15 实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化效率检测. 18 实验五 重组质粒的转化. 20 实验六 重组质粒DNA的提取及酶切鉴定. 23 实验七 RNA的提取（TRIzol法）. 30 实验八 mRNA的分离与纯化. 36 实验九 RT-PCR技术. 38 实验十 用mRNA差异显示法分离特异表达的基因片段 . 40 实验十一 cDNA文库的构建. 46 实验十二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） . 51 实验十三 Southern印迹杂交法（Southern blot）. 56 实验十四 RNA分子杂交（Northern blot）. 62 实验十五 固定化蛋白质的免疫生化鉴定（Western blot）. 67 实验十六 RFLP技术. 71 实验十七 RAPD技术. 74 实验十八 细胞分裂中期染色体的荧光原位杂交技术(FISH). 76 附录一 常用缓冲液及其配制. 80 附录二 常用抗生素溶液. 85 附录三 常用贮存液的配制. 85 附录四 常用核酸蛋白换算数据. 93 附录五 染料在凝胶中的迁移速度. 94 附录六 实验中的一些好习惯. 95
实验一 植物基因组DNA的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分 光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 通过CTAB法提取植物基因组DNA是由Murray和Thompson(I98O)修改而成的简便方 法。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下 (大于0.7MNCI),与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氨对植物组织进行研磨， 从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋 白，最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术.把DNA样品加入到一块包含电解 质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子 筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电 荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本 身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，DNA分子的迁移 速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁 移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA,也 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如pUC19质粒，有3种构型：超螺 旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA,简称cccDNA),开环质粒DNA, 即环状质粒DNA的I条链断裂，(open circular DNA,简称ocDNA),线状质粒DNA,即环 状质粒DNA的2条链在同一处发生断裂(linear DNA,简称LDNA).这3种构型的质粒DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次
1 实验一 植物基因组 DNA 的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用 CTAB 法从植物组织中提取 DNA 并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分 光光度法对 DNA 进行定性定量分析。 【实验原理】 通过 CTAB 法提取植物基因组 DNA 是由 Murray 和 Thompson (1980) 修改而成的简便方 法。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下 (大于 0.7M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨， 从而破碎细胞。然后加入 CTAB 缓冲液将 DNA 溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋 白，最后经乙醇沉淀得到 DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化 DNA 片段的常用技术。把 DNA 样品加入到一块包含电解 质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子 筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电 荷，因此，在一定的电场强度下，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本 身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样，DNA 分子的迁移 速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的 DNA 分子比分子量大的 DNA 分子迁 移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的 DNA，也 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子。如 pUC19 质粒，有 3 种构型：超螺 旋的共价闭合环状质粒 DNA(covalently closed circular DNA，简称 cccDNA)，开环质粒 DNA， 即环状质粒 DNA 的 1 条链断裂，(open circular DNA，简称 ocDNA)，线状质粒 DNA，即环 状质粒 DNA 的 2 条链在同一处发生断裂(linear DNA，简称 L DNA）。这 3 种构型的质粒 DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈 3 条带，超螺旋质粒 DNA 泳动最快，其次
为线状DNA,最慢的为开环质粒DNA 核酸分子(DNA或RNA)油于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在26Om波长处有特异的 紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基 础。1OD26o相当于dsDNA50μgmL,ssDNA33μgmL和ssRNA40ugmL。可以此来计算核酸 样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260nm和280nm的紫外 线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有 RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系 统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000u山 量程各一支)、胶带、100mL或250mL锥形瓶、量筒、陶瓷研钵、液氮、研磨棒、点样板或 parafilm、吸头、l.5mlEP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(TiS)、乙二胺四乙酸(EDTA人CTAB(十六烷基三甲基溴化铵、B巯 基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠NaC)、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、 蔗糖、琼脂糖、溴化乙锭、盐酸。 三、试剂 1.2xCTAB buffer 配50ml 100mM Tris-Cl pH8.0 5mL1M贮存液 1.4M NaCl 17.5mL4M贮存液 20 mM EDTA pH8.0 2mL0.5M贮存液 2%CTAB 需CTAB固体粉末1g 0.2%巯基乙醇 需巯基乙醇100 2.70%乙醇 3.RNaseA(10mg/mL) 2
2 为线状 DNA，最慢的为开环质粒 DNA。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌吟环和嘧啶环的共轭双键，在 260nm波长处有特异的 紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基 础。1 OD260相当于dsDNA 50μg/mL，ssDNA 33μg/mL和ssRNA 40μg/mL。可以此来计算核酸 样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定 260nm和 280nm的紫外 线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280 比值高于 2.0，则可能有 RNA污染，低于 1.8 则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系 统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000μL 量程各一支)、胶带、100 mL 或 250 mL 锥形瓶、量筒、陶瓷研钵、液氮、研磨棒、点样板或 parafilm、吸头、1.5 ml EP 管、PE 手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA )、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β-巯 基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA ) 、溴酚蓝、 蔗糖、琼脂糖、溴化乙锭、盐酸。 三、试剂 1. 2×CTAB buffer 配 50mL 100mM Tris-Cl pH8.0 5 mL 1M 贮存液 1.4M NaCl 17.5 mL 4M 贮存液 20 mM EDTA pH8.0 2 mL 0.5M 贮存液 2% CTAB 需 CTAB 固体粉末 1g 0.2%巯基乙醇 需巯基乙醇 100 μL 2. 70%乙醇 3. RNaseA (10mg/mL)