5.分离基因组DNA和质粒DNA有哪些不同之处？ 6.CTAB、苯酚、氯仿、乙醇等的作用？ 7.电泳时如何确定琼脂糖浓度？ 8.如何配制电泳缓冲液TBE? 9.试分析自己实验得到的电泳结果？ 10.EB染色的特点和注意事项是什么？ 1山.上样缓冲液在电泳中起什么作用？ 12.DNA定量时，什么方法比较精确？ 13.紫外分光光度法测定DNA浓度的原理？ 14,DNA样品的A26O/A280比值如何反应DNA的纯度？ 15.DNA样品的A260/A280比值大于2.0或小于1.8时应该如何处理才能提高DNA纯度？ 实验二PCR扩增目的片段和胶回收 【实验目的】 通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术及DNA片段的胶回收方法。 【实验原理】 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是一种体外核酸扩增系统，其原理 类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引 物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2”倍。该技术已成为分子生物学中用于 DNA克隆及基因分析的必需工具。 典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的 DNA引物、耐热DNA聚合酶。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡 核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。整个扩增 过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段： ②退火，快速降低温度至50-60℃后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶 8
8 5. 分离基因组 DNA 和质粒 DNA 有哪些不同之处？ 6. CTAB、苯酚、氯仿、乙醇等的作用？ 7. 电泳时如何确定琼脂糖浓度？ 8. 如何配制电泳缓冲液 TBE？ 9. 试分析自己实验得到的电泳结果？ 10. EB 染色的特点和注意事项是什么？ 11. 上样缓冲液在电泳中起什么作用？ 12. DNA 定量时，什么方法比较精确？ 13. 紫外分光光度法测定 DNA 浓度的原理？ 14. DNA 样品的 A260/A280 比值如何反应 DNA 的纯度？ 15. DNA样品的A260/A280比值大于2.0或小于1.8时应该如何处理才能提高DNA纯度？ 实验二 PCR 扩增目的片段和胶回收 【实验目的】 通过本实验学习 PCR 反应的基本原理与实验技术及 DNA 片段的胶回收方法。 【实验原理】 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理 类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引 物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增 2n 倍。该技术已成为分子生物学中用于 DNA克隆及基因分析的必需工具。 典型的PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的 DNA引物、耐热DNA聚合酶。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡 核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。整个扩增 过程分三步：① 变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段； ② 退火，快速降低温度至 50-60℃后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶
段：③延伸，溶液反应温度升至72C,耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导 下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(NTP),按5'一3'方向复制出互补DNA, 即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加 倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过2530个循环后，DNA可扩增10-10倍。 PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。现用图示说明PCR原理： 模板(Total) 模板5A L 目的DNA 思，箱环02A+L+8 变性退火 循环1 A+L.LL+B 延伸 4101 变性退火 循环2 延伸 8222 循环3 16383 循环n2n2”2mn 图2-1PCR基本原理示意图 Taq DNA聚合酶就是在PCR中常用的一种耐热DNA聚合酶，该酶分离自水生栖热菌， 分子量为94,000，最适反应温度75℃，对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3”→5外切 酶活性，合成的DNA双链3”端常有一个突出的碱基A,便于与3端有突出T的线性载体 (如T载体)直接进行重组连接，该特点在DNA重组中使用非常方便。 分离和纯化PCR产物及DNA酶切片段是基因工程中常用的手段。在电泳过程中不同大 9
段；③ 延伸，溶液反应温度升至 72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导 下，利用反应混合物中的 4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP)，按 5’→3’ 方向复制出互补DNA， 即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一 倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过 25-30 个循环后，DNA可扩增 106 -109 倍。 PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。现用图示说明PCR原理： 图 2-1 PCR 基本原理示意图 Taq DNA 聚合酶就是在 PCR 中常用的一种耐热 DNA 聚合酶，该酶分离自水生栖热菌， 分子量为 94,000，最适反应温度 75℃，对 95℃高温具良好稳定性，该酶不存在 3’→5’ 外切 酶活性，合成的 DNA 双链 3’ 端常有一个突出的碱基 A，便于与 3’ 端有突出 T 的线性载体 （如 T-载体）直接进行重组连接，该特点在 DNA 重组中使用非常方便。 分离和纯化 PCR 产物及 DNA 酶切片段是基因工程中常用的手段。在电泳过程中不同大 9
小的片段分离后位于凝胶的不同位置，切下目的片段并采用低熔点琼脂糖回收法即可获得目 的片段。有许多型号的低熔点琼脂糖可在65℃时熔化成液体，在30℃时凝固成凝胶。由于 双链DNA的解链温度高于65℃，所以可以熔化凝胶而DNA并不变性，在凝胶成液态时回 收DNA片段。该法的优点是可直接在熔化的凝胶中进行各种酶反应，如合成同位素探针、 进行限制酶切割和连接反应等， 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 PCR热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器(0.1-2.5uL)、200 uLPCR 管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器(10、100、1000μL量程各一支)、胶带 1o0mL或250mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、吸头、PE手套和乳胶手套。 二、试剂 1.10×缓冲液 500 mmol/L KCI 100 mmol/L Tris-.C1(pH8.3,室温) 15 mmol/L MgClz 2.DNA模板 1ngmL(以实验一提取的拟南芥基因组DNA为模板) 3.dNTP Mix 2.5 mmol/L dATP 2.5 mmol/L dCTP 2.5mmol/L dGTP 2.5 mmol/L dTTP 4.引物 引物15'GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA3 引物25'CTC CTT AAT CTC ACG CAC GAT TTC3 引物溶液浓度：2μM 5.Taq酶5U/L
10 小的片段分离后位于凝胶的不同位置，切下目的片段并采用低熔点琼脂糖回收法即可获得目 的片段。有许多型号的低熔点琼脂糖可在 65℃时熔化成液体，在 30℃时凝固成凝胶。由于 双链 DNA 的解链温度高于 65℃，所以可以熔化凝胶而 DNA 并不变性，在凝胶成液态时回 收 DNA 片段。该法的优点是可直接在熔化的凝胶中进行各种酶反应，如合成同位素探针、 进行限制酶切割和连接反应等。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 PCR 热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（0.1-2.5μL）、200μL PCR 管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000μL 量程各一支）、胶带、 100 mL 或 250 mL 锥形瓶、量筒、点样板或 parafilm、吸头、PE 手套和乳胶手套。 二、试剂 1. 10 × 缓冲液 500 mmol/L KCl 100 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.3，室温） 15 mmol/L MgCl2 2. DNA 模板 1 ng/μL (以实验一提取的拟南芥基因组 DNA 为模板) 3. dNTP Mix 2.5 mmol/L dATP 2.5 mmol/L dCTP 2.5mmol/L dGTP 2.5 mmol/L dTTP 4．引物 引物 1 5′ GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA 3′ 引物 2 5′ CTC CTT AAT CTC ACG CAC GAT TTC 3′ 引物溶液浓度：2μM 5. Taq 酶 5 U/μL
6.低熔点琼脂糖 7.凝胶回收试剂盒 8.去离子水或TE(pH7.6) 【实验步骤】 1.在200 uLPCR管内配制20uL反应体系： 反应物 体积L ddH2O 10.3 10×PCR缓冲液 2.0 dNTP 1.6(终浓度20-200uM) 引物1 2.0 引物2 2.0 模板DNA 2.0 Tag酶 Total 20 视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 2.将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6000pm离心15sc使反 应成分集于管底。 3.PCR反应热循环程序设置： ①94℃预变性3min; ②94℃变性30s ③58℃退火30s 30cycles ④72℃延伸1min30s ⑤72℃延伸4min ⑥4℃pause 反应结束后短暂离心，置4℃保存备用。 4.配制1%的琼脂糖凝胶
6. 低熔点琼脂糖 7. 凝胶回收试剂盒 8. 去离子水或 TE（pH7.6） 【实验步骤】 1．在 200μL PCR 管内配制 20μL 反应体系： 反应物 体积 /μL ddH2O 10.3 10×PCR 缓冲液 2.0 dNTP 1.6（终浓度 20－200μM） 引物１ 2.0 引物 2 2.0 模板 DNA 2.0 Tag 酶 0.1 Total 20 视 PCR 仪有无热盖，不加或添加石蜡油。 2. 将上述试剂依次加入 PCR 薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6000 rpm 离心 15 sec 使反 应成分集于管底。 3. PCR 反应热循环程序设置： ① 94 ℃ 预变性 3 min; ② 94 ℃ 变性 30s; ③ 58 ℃ 退火 30s; 30 cycles ④ 72 ℃ 延伸 1 min30s; ⑤ 72 ℃ 延伸 4 min; ⑥ 4℃ pause 反应结束后短暂离心，置 4℃保存备用。 4. 配制 1％的琼脂糖凝胶。 11
5.将PCR产物进行电泳。 6.在紫外灯下切含有DNA的低熔点胶，置1.5mL离心管中，于70℃热水中熔化。 7.按凝胶回收试剂盒说明书操作。 8.取适量纯化好的目的DNA于分光光度计中检测纯度和浓度，其余样品于-20℃保存。 【实验结果】 本实验扩增片段长1,080bp。 图2-2PCR产物电泳结果 (图片左侧为PCR产物，右侧为DNA相对分子质量标准物marker DL2OO0) 【实验安排】 本实验1天内可完成，上午做PCR反应，下午做电泳检测及胶回收。 【注意事项】 1.PC℉体系所加成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液 浓度进行核算。 2.加样时要认真，吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在己加的样品 2
5. 将 PCR 产物进行电泳。 6. 在紫外灯下切含有 DNA 的低熔点胶，置 1.5 mL 离心管中，于 70℃热水中熔化。 7. 按凝胶回收试剂盒说明书操作。 8. 取适量纯化好的目的 DNA 于分光光度计中检测纯度和浓度，其余样品于-20℃保存。 【实验结果】 本实验扩增片段长 1,080 bp。 图 2-2 PCR 产物电泳结果 （图片左侧为 PCR 产物，右侧为 DNA 相对分子质量标准物 marker DL2000） 【实验安排】 本实验 l 天内可完成，上午做 PCR 反应，下午做电泳检测及胶回收。 【注意事项】 1. PCR 体系所加成分的实际用量应根据实验者选用的该成分的终浓度及所拥有的贮备液 浓度进行核算。 2. 加样时要认真，吸头垂直进入试剂管，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品 12