4.0.5×TBE缓冲液（工作浓度） 45 nM Tris-硼酸盐 1mM EDTA 配5×TBE(贮存液)1000mL Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5 mol/L EDTA 20mL(pH8.0) 5.凝胶加样缓冲液(6×) 溴酚蓝 0.25% 蔗糖 40% 6.溴化乙锭(EB)贮存液10mgmL 7.DNA marker 8.0.1×TE 9.酚/氯仿(1：1，VW) 【实验步躁】 1.取约100mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5mLEP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。 2.加入0.6mL2×CTAB提取液（用前加入0.2%的巯基乙醇），混匀，65℃水浴30min 每10min颠倒混匀一次。 3.取出离心管，冷却后加入0.6mL酚氯仿混合液，混匀。 4.13,000pm室温离心4min(若没离好可重复一次). 5.将上清液转移到另一1.5mL离心管中。 6.加等体积氯仿混匀，13,000pm离心4min,取上清。 7.加入2倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置60min。 8.4℃，15.000rpm离心20min。 9.弃上清，70%乙醇洗沉淀2次，风干。 10.加入25L无菌水（含25 g/mL RNase A),溶解DNA
3 4. 0.5×TBE 缓冲液(工作浓度) 45mM Tris-硼酸盐 1mM EDTA 配 5×TBE (贮存液) 1000 mL Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5 mol/L EDTA 20 mL (pH 8.0) 5. 凝胶加样缓冲液(6×) 溴酚蓝 0.25 % 蔗糖 40 % 6. 溴化乙锭 (EB ) 贮存液 10mg/mL 7. DNA marker 8. 0.1×TE 9. 酚/氯仿 (1:1，V/V)。 【实验步骤】 1. 取约 100mg 新鲜的拟南芥嫩叶放入 1.5mL EP 管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。 2. 加入 0.6 mL 2×CTAB 提取液(用前加入 0.2﹪的巯基乙醇)，混匀，65℃ 水浴 30 min， 每 10 min 颠倒混匀一次。 3. 取出离心管，冷却后加入 0.6 mL 酚氯仿混合液，混匀。 4. 13,000 rpm 室温离心 4 min(若没离好可重复一次)。 5. 将上清液转移到另一 1.5mL 离心管中。 6. 加等体积氯仿混匀，13,000rpm 离心 4 min，取上清。 7. 加入 2 倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，-20℃放置 60 min。 8. 4℃，15,000rpm 离心 20 min。 9. 弃上清，70％乙醇洗沉淀 2 次，风干。 10. 加入 25 μL 无菌水(含 25μg/mL RNase A)，溶解 DNA
1L.取1LDNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测 ()制备琼脂糖凝胶 按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度/% 线性DNA的有效分离范围/kb 0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1.3 称取0.3g琼脂糖，放入三角瓶中，加入30L0.5×TBE缓冲液，置微波炉或水浴加热至 完全溶化，取出摇匀，则为1%琼脂糖凝胶液。 琼脂糖由D-半乳糖和L半乳糖通过糖苷键交替形成线状聚合物。琼脂糖溶解后链间糖 分子上的羟基由于氢键的作用相互连接，形成三维空间结构，琼脂糖浓度越高，形成的孔隙 越小，分辨能力也越强。琼脂糖凝胶的分辨范围一般在0.2-50kb之间。 (2)胶板的制备 ①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮音或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一 定封严，不能留缝隙)，形成一个模具。 ②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 ③将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形 成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 ④室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30-45min),垂直轻拔杭子，取下胶带，将凝 胶及内槽放入电泳槽中。 ⑤加电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1mm。 (3)加样 4
4 11. 取 1μL DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳检测： (1) 制备琼脂糖凝胶 按照被分离 DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表： 琼脂糖凝胶浓度/％ 线性 DNA 的有效分离范围／kb 0.3 5 - 60 0.6 1 - 20 0.7 0.8 - 10 0.9 0.5 - 7 1.2 0.4 - 6 1.5 0.2 - 4 2.0 0.1 - 3 称取 0.3g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入 30mL0.5×TBE 缓冲液，置微波炉或水浴加热至 完全溶化，取出摇匀，则为 1％琼脂糖凝胶液。 琼脂糖由 D-半乳糖和 L-半乳糖通过糖苷键交替形成线状聚合物。琼脂糖溶解后链间糖 分子上的羟基由于氢键的作用相互连接，形成三维空间结构，琼脂糖浓度越高，形成的孔隙 越小，分辨能力也越强。琼脂糖凝胶的分辨范围一般在 0.2-50kb 之间。 (2) 胶板的制备 ① 取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一 定封严，不能留缝隙），形成一个模具。 ② 将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。 ③ 将冷却到 60℃ 左右的琼脂糖凝胶液，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形 成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。 ④ 室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下 30-45 min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝 胶及内槽放入电泳槽中。 ⑤ 加电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约 1mm。 (3) 加样
在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不 小于I×。用1OuL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNA marker分别加至 样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏 样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 上样缓冲液有三个作用：增加样品的密度以保证DNA沉入加样孔内：使样品带有颜色 便于简化上样过程：其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝是带电 荷的小分子化合物，呈蓝紫色，是一种凝胶的示踪染料，迁移速率相当于300p的线性双链 DNA分子，通过观察溴酚蓝的迁移位置，可估计样品中DNA分子的迁移位置， (④电泳 ①接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移 动)。DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此， 最高电压不超过5Vlcm。 ②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。 (⑤染色 将电泳后的凝胶浸入含有0.5ugmL溴化乙锭的电泳缓冲液中，染色（室温30-45min), 清水脱色10mi,紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保 存。 溴化乙锭(Ethidium bromide,EB),是一种扁平的分子，能嵌入核酸分子相邻的碱基之 间，可以和DNA形成络合物，并在约30Om波长的紫外光下发射出桔红色荧光，使DNA 分子在凝胶中便于鉴定。 12.紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度： (1)用0.1×TE对待测DNA样品按120或合适的倍数稀释。 (2)开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready'” 时，进入核酸测定窗口。 (3)调零。先用0.l×TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref键，仪 器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。 5
5 在点样板或 parafilm 上混合 DNA 样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不 小于 1×。用 10μL 微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将 DNA marker 分别加至 样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏 样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。 上样缓冲液有三个作用：增加样品的密度以保证 DNA 沉入加样孔内；使样品带有颜色 便于简化上样过程；其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。溴酚蓝是带电 荷的小分子化合物，呈蓝紫色，是一种凝胶的示踪染料，迁移速率相当于 300bp 的线性双链 DNA 分子，通过观察溴酚蓝的迁移位置，可估计样品中 DNA 分子的迁移位置。 (4) 电泳 ① 接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA 片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移 动）。DNA 的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此， 最高电压不超过 5V/cm。 ② 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿 1-2cm 处，停止电泳。 (5) 染色 将电泳后的凝胶浸入含有 0.5 μg/mL 溴化乙锭的电泳缓冲液中，染色（室温 30-45min）， 清水脱色 10min，紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保 存。 溴化乙锭（Ethidium bromide, EB），是一种扁平的分子，能嵌入核酸分子相邻的碱基之 间，可以和 DNA 形成络合物，并在约 300nm 波长的紫外光下发射出桔红色荧光，使 DNA 分子在凝胶中便于鉴定。 12.紫外分光光度法测定 DNA 浓度及纯度： (1) 用 0.1×TE 对待测 DNA 样品按 1:20 或合适的倍数稀释。 (2) 开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready” 时，进入核酸测定窗口。 (3) 调零。先用 0.1×TE 缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键，仪 器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品
(4)吸7OL已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很 少，可以用5~TuL的石英样品杯。点击“enter'”键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260 和280nm处的光密度(OD值)及A260/A280nm和A280/A260nm的比率以及DNA样品的 浓度等。 (⑤)打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入 下一个待测样品。 (6)DNA纯度：以A260/A280比值来反映。当A2601A280比值<1.8时，说明样品存在 蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除 残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE溶解后再测定。当A260/A280比值>2.0，说明样品存在RNA 污染，可以用RNA酶处理样品去除RNA 【实验结果】 在紫外灯(360nm,312nm或254nm)下观察染色后的电泳凝胶（图1-1）。DNA存 在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作 用)。 图1-1拟南芥基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果 6
(4) 吸 70μL 已稀释的 DNA 样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很 少，可以用 5～7μL 的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示 260 和 280nm 处的光密度（OD 值）及 A260/A280nm 和 A280/A260nm 的比率以及 DNA 样品的 浓度等。 (5) 打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加入 下一个待测样品。 (6) DNA 纯度：以 A260/ A280 比值来反映。当 A260 /A280 比值<1.8 时，说明样品存在 蛋白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除 残留酚，再用无水乙醇沉淀，TE 溶解后再测定。当 A260/A280 比值>2.0，说明样品存在 RNA 污染，可以用 RNA 酶处理样品去除 RNA。 【实验结果】 在紫外灯（360 nm, 312 nm 或 254 nm ）下观察染色后的电泳凝胶（图 1-1）。DNA 存 在处应显出桔红色荧光条带（在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作 用）。 图 1-1 拟南芥基因组 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果 6
【实验安排】 本实验一天内可完成：上午提DNA,下午电泳及紫外分光光度法检测DNA。 【注意事项】 1.尽量选幼嫩叶片，如太老，DNA可能已经开始降解，有些物种老叶子酚类物质较多。 2.研磨过程中确保样品不要融化，直至加CTAB 3.酚-氯仿抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪口的，带手套操作。 4.所用试剂需灭菌。 5.配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。 6.琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 7.电泳时应注意电源线路，预防触电。 8.溴化乙锭具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验 室内使用。 9.紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。 1O.DNA带形状模糊：DNA加样过多；电压太高：凝胶中有气泡。 11.紫外分光光度法不能区分DNA分子的构型，如质粒DNA分子的超螺旋、开环、线 状三种构型，也不能区分染色体DNA和RNA等。由于测定吸收光度A260时，难以排除苯 酚、RNA、染色体DNA、以及DNA解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往比 实际浓度偏高。 12.测样品时使用的石英样品杯比较贵，操作时要小心，不要摔破：持杯时不要接触透 明的光面以避免干扰测定。 【复习思考题】 1.提取DNA之前一些耗材和试剂为什么要先进行高压灭菌？ 2.提取DNA的主要步骤有哪些？需要注意哪些问题？ 3.如何检测、评价提取的DNA的质量？ 4.如何确定提取的DNA的浓度？ 1
7 【实验安排】 本实验一天内可完成：上午提 DNA，下午电泳及紫外分光光度法检测 DNA。 【注意事项】 1．尽量选幼嫩叶片，如太老，DNA 可能已经开始降解，有些物种老叶子酚类物质较多。 2．研磨过程中确保样品不要融化，直至加 CTAB 3．酚-氯仿抽提时动作应轻柔，转移用的枪头最好是剪口的，带手套操作。 4．所用试剂需灭菌。 5．配琼脂糖时应使其完全熔化后方可制胶。 6．琼脂糖凝胶易于破碎，操作时要轻缓。 7．电泳时应注意电源线路，预防触电。 8．溴化乙锭具有致癌作用，配制及使用时应带乳胶或一次性塑料手套。并在专门的实验 室内使用。 9．紫外线对人体有损伤作用，开灯时间不宜太长，注意防护。 10．DNA 带形状模糊：DNA 加样过多；电压太高；凝胶中有气泡。 11．紫外分光光度法不能区分 DNA 分子的构型，如质粒 DNA 分子的超螺旋、开环、线 状三种构型，也不能区分染色体 DNA 和 RNA 等。由于测定吸收光度 A260 时，难以排除苯 酚、RNA、染色体 DNA、以及 DNA 解链的增色效应等因素的影响，因此测得的数据往往比 实际浓度偏高。 12．测样品时使用的石英样品杯比较贵，操作时要小心，不要摔破；持杯时不要接触透 明的光面以避免干扰测定。 【复习思考题】 1. 提取 DNA 之前一些耗材和试剂为什么要先进行高压灭菌？ 2. 提取 DNA 的主要步骤有哪些？需要注意哪些问题？ 3. 如何检测、评价提取的 DNA 的质量？ 4. 如何确定提取的 DNA 的浓度？