凯氏定氮仪主要由蒸汽发生器,反应管及冷凝器三部分组成 蒸汽发生器包括电炉及一个12升容积的烧瓶。蒸汽发生器借橡皮管与反应 管相连,反应管上端有一个小漏斗,样品和碱液可由此加入到反应室,反应室中 心有一长玻璃管,与蒸汽发生器相连,下端靠近反应室的底部。反应产生的氨可 通过反应室上安全管及冷凝器通过吸收瓶中。安装时各连接处不能漏气,且安装 好的不可轻易移动,以免仪器损坏 2.样品处理 某一固体样品中的含氮量是用100克该物质(干重)中所含氮的克数来表示 (%)。因此在定氮前,应先将固体样品中的水份除掉。一般样品烘干的温度都采 用105℃,因为非游离的水,都不能在100℃以下烘干。 在称量瓶中称入一定量磨细的样品,然后置于105℃的烘箱内干燥4小时 用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内,待降至室温后称量,按上述操作继续烘干样品。 每干燥1小时后,称重一次,直到两次称量数值不变,即达恒重 若样品为液体(如血清等),可取一定体积样品直接消化测定。 精确称取0.1克左右的干燥面粉作为实验的样品。 3.消化: 取四个l0oml凯氏烧瓶并标号。各加1颗玻璃珠,在1及2号瓶中各加样品 0.1克,催化剂200毫克,浓硫酸5毫升,注意加样品时应直接送入瓶底,而不 要沾在瓶口和瓶颈上。在3及4号瓶中各加0.1毫升蒸馏水和与1及2号瓶相同 量的催化剂和浓硫酸,作为对照,用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。加 完后,将这四个烧瓶放在通风橱内的电炉上消化。 在消化开始时应控制火力,不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完,硫酸开始分 解并放出SO2白烟后,适当加强火力,继续消化,直至消化液呈透明淡绿色为止① 消化完毕,等烧瓶内容物冷却后,加蒸馏水10毫升(注意慢加,随加随摇)。冷 却后将瓶中内容物倾入50毫升的容量瓶中,并以蒸馏水洗烧瓶数次,将洗液并 入溶量瓶。用水稀释到刻度,混匀备用°。 4.蒸馏: (1)蒸馏器的洗涤:在蒸汽发生瓶中加入三分之二体积的蒸馏水,加浓硫 酸数滴及毛细管或玻珠若干,关闭甲乙,将蒸汽发生器中的水烧开,让蒸汽通过 整个仪器。并检査有无漏气,5分钟后,打开活塞乙,使蒸汽洗涤漏斗5分钟
11 凯氏定氮仪主要由蒸汽发生器，反应管及冷凝器三部分组成： 蒸汽发生器包括电炉及一个 1~2 升容积的烧瓶。蒸汽发生器借橡皮管与反应 管相连，反应管上端有一个小漏斗，样品和碱液可由此加入到反应室，反应室中 心有一长玻璃管，与蒸汽发生器相连，下端靠近反应室的底部。反应产生的氨可 通过反应室上安全管及冷凝器通过吸收瓶中。安装时各连接处不能漏气，且安装 好的不可轻易移动，以免仪器损坏。 2．样品处理： 某一固体样品中的含氮量是用 100 克该物质（干重）中所含氮的克数来表示 （%）。因此在定氮前，应先将固体样品中的水份除掉。一般样品烘干的温度都采 用 105℃，因为非游离的水，都不能在 100℃以下烘干。 在称量瓶中称入一定量磨细的样品，然后置于 105℃的烘箱内干燥 4 小时。 用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称量，按上述操作继续烘干样品。 每干燥 1 小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。 若样品为液体（如血清等），可取一定体积样品直接消化测定。 精确称取 0.1 克左右的干燥面粉作为实验的样品。 3．消化： 取四个 100ml 凯氏烧瓶并标号。各加 1 颗玻璃珠，在 1 及 2 号瓶中各加样品 0.1 克，催化剂 200 毫克，浓硫酸 5 毫升，注意加样品时应直接送入瓶底，而不 要沾在瓶口和瓶颈上。在 3 及 4 号瓶中各加 0.1 毫升蒸馏水和与 1 及 2 号瓶相同 量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。加 完后，将这四个烧瓶放在通风橱内的电炉上消化。 在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分 解并放出 SO2白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止①。 消化完毕，等烧瓶内容物冷却后，加蒸馏水 10 毫升（注意慢加，随加随摇）。冷 却后将瓶中内容物倾入 50 毫升的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并 入溶量瓶。用水稀释到刻度，混匀备用②。 4．蒸馏： （1）蒸馏器的洗涤：在蒸汽发生瓶中加入三分之二体积的蒸馏水，加浓硫 酸数滴及毛细管或玻珠若干，关闭甲乙，将蒸汽发生器中的水烧开，让蒸汽通过 整个仪器。并检查有无漏气，5 分钟后，打开活塞乙，使蒸汽洗涤漏斗 5 分钟
复将乙关闭,继续蒸馏约5分钟,然后在冷凝器下端放一个盛有5毫升%硼酸 溶液和1-2滴指示剂混合液的锥形瓶。位置倾斜如图,冷凝器下端应完全浸没 在液体中,继续蒸汽洗涤1-2分钟,观察锥形瓶内的溶液是否变色,如不变色 则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。向下移动锥形瓶,使硼酸液面离开冷凝管口约 l厘米,继续通蒸汽1分钟,最后用水冲洗冷凝管口。然后移去或关掉电炉,由 于蒸汽发生器内蒸气冷缩,压力减低,反应室内的水可自动吸出进入废液管中(图 中3),打开甲,将废液排出。 (2)蒸馏:取50毫升锥形瓶数个,各加5毫升硼酸和1-2滴指示剂,溶液 呈紫红色,用表面皿覆盖备用。关掉电炉,打开活塞甲、乙,再将事先准备好的 盛有5皿l馮%硼酸及指示剂的锥形瓶放在冷凝管中下,使管口浸入液面以下。用吸 管取l0ml消化液,细心地由小漏斗处注入反应室,用2—3ml蒸馏水洗涤小漏斗, 待消化液全部进入反应室后关闭活塞甲。然后再由小漏斗处加30%NaOH0m1(用 小量筒量取),让NaOH缓缓流入反应室,当小漏斗内仍有少量NaOH时,即关闭 乙,再用约3ml蒸馏水于小漏斗内,同样放入反应室,并留少量水在漏斗内作水 封,关闭乙,立即加热蒸汽发生器,并使沸腾,开始蒸馏。待三角烧瓶中液体由 紫红色变成蓝绿色时再继续蒸馏3分钟,将三角烧瓶下降,使冷凝管口离开液面 约lcm,继续蒸1分钟,用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口,洗液直接流入锥开瓶内 然后,先移去锥形瓶,关掉电炉,使反应室内废液倒吸进入废液管内,打开甲而 放出。整个蒸馏装置立即洗涤(包括水洗及蒸汽洗)备用。待样品和空白消化液 均蒸馏完毕后,同时进行滴定 (3)滴定:全部蒸馏完毕后,用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量, 硼酸指示溶液由蓝绿变淡紫红色为滴定终点。 五、结果与讨论: 1.计算: 总氮量=c(1-H2)×014×100×消化液总量(m 测定时消化液用量(m C:标准盐酸溶液摩尔浓度。 V1:滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。 V2:滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。 W:样品重量(克)
12 复将乙关闭，继续蒸馏约 5 分钟，然后在冷凝器下端放一个盛有 5 毫升 2%硼酸 溶液和 1—2 滴指示剂混合液的锥形瓶。位置倾斜如图，冷凝器下端应完全浸没 在液体中，继续蒸汽洗涤 1—2 分钟，观察锥形瓶内的溶液是否变色，如不变色 则证明蒸馏装置内部已洗涤干净。向下移动锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约 1 厘米，继续通蒸汽 1 分钟，最后用水冲洗冷凝管口。然后移去或关掉电炉，由 于蒸汽发生器内蒸气冷缩，压力减低，反应室内的水可自动吸出进入废液管中（图 中 3），打开甲，将废液排出。 （2）蒸馏：取 50 毫升锥形瓶数个，各加 5 毫升硼酸和 1—2 滴指示剂，溶液 呈紫红色，用表面皿覆盖备用。关掉电炉，打开活塞甲、乙，再将事先准备好的 盛有 5ml2%硼酸及指示剂的锥形瓶放在冷凝管中下，使管口浸入液面以下。用吸 管取 10ml 消化液，细心地由小漏斗处注入反应室，用 2—3ml 蒸馏水洗涤小漏斗， 待消化液全部进入反应室后关闭活塞甲。然后再由小漏斗处加 30%NaOH10ml（用 小量筒量取），让 NaOH 缓缓流入反应室，当小漏斗内仍有少量 NaOH 时，即关闭 乙，再用约 3ml 蒸馏水于小漏斗内，同样放入反应室，并留少量水在漏斗内作水 封，关闭乙，立即加热蒸汽发生器，并使沸腾，开始蒸馏。待三角烧瓶中液体由 紫红色变成蓝绿色时再继续蒸馏 3 分钟，将三角烧瓶下降，使冷凝管口离开液面 约 1cm，继续蒸 1 分钟，用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口，洗液直接流入锥开瓶内， 然后，先移去锥形瓶，关掉电炉，使反应室内废液倒吸进入废液管内，打开甲而 放出。整个蒸馏装置立即洗涤（包括水洗及蒸汽洗）备用。待样品和空白消化液 均蒸馏完毕后，同时进行滴定。 （3）滴定：全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量， 硼酸指示溶液由蓝绿变淡紫红色为滴定终点。 五、结果与讨论： 1．计算： 总氮量= W c(V1 −V2 )0.014100 × ( ) (ml) ml 测定时消化液用量 消化液总量 ×% C：标准盐酸溶液摩尔浓度。 V1：滴定样品用去的盐酸溶液平均毫升数。 V2：滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均毫升数。 W：样品重量（克）
14:氮的原子量。 若测定的样品含氮部分只是蛋白质,则样品中蛋白质含量(%)=总氮量 6.25,若样品中除有蛋白质外,尚有其它含氮物质,则需向样品中加入三氯乙酸, 然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸的样品上清液中的含氮量,得出非 蛋白氮及总氮量,从而教育处出蛋白氮,再进一步算出蛋白质含量 蛋白氮=总氮一非蛋白氮 蛋白质含量(克%)=蛋白氮×6.25 六、思考题 1.写出实验中应注意的主要事项 2.指出该法测定蛋白质含量的局限性。 3.指出其它测定蛋白质含量的方法
13 14：氮的原子量。 若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量（%）=总氮量× 6.25，若样品中除有蛋白质外，尚有其它含氮物质，则需向样品中加入三氯乙酸， 然后测定未加三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸的样品上清液中的含氮量，得出非 蛋白氮及总氮量，从而教育处出蛋白氮，再进一步算出蛋白质含量。 蛋白氮=总氮—非蛋白氮 蛋白质含量（克%）=蛋白氮×6.25 六、思考题 1.写出实验中应注意的主要事项。 2.指出该法测定蛋白质含量的局限性。 3.指出其它测定蛋白质含量的方法
实验五蛋白质的性质实验—蛋白质及氨基酸的 呈色反应 、实验目的 1.了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式 2.了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理 3.学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法 双缩脲反应 、实验原理 尿素加热至180℃左右,生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中 能与Cu2+结合生成紫红色化合物,此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键, 其结构与双缩脲相似,也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定 双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个一C NH2,一CH2-NH2,一 CRH-NH2,一CH2-NH2-CHNH2-CH2OH或 CHOHCH2NH2等基团 NH2 NH2 的物质以及乙二酰二胺(O=C-C=0)等物质也有此反应。NH3也干扰此反 应,因为NH与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu(NH3)42+。因此,一切蛋白质 或二肽以上的多肽都有双缩脲反应,但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或 多肽 三、材料、仪器与试剂 尿素:10%氢氧化钠溶液;1%硫酸铜溶液:2%卵清蛋白溶液 四、实验操作 取少量尿素结晶,放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素 开始硬化时,停止加热,尿素放出氨,形成双缩脲。冷后,加10%氢氧化钠溶液 约lml,振荡混匀,再加1%硫酸铜溶液Ⅰ滴,再振荡。观察出现的粉红颜色。 要避免添加过量硫酸铜,否则,生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 向另一试管加卵清蛋白溶液约lm和10%氢氧化钠溶液约2ml,摇匀,再 加1%硫酸铜溶液2滴,随加随摇。观察紫玫瑰色的岀现。 茚三酮反应 二、实验原理 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外,所有α一氨基酸及一 切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质
14 实验五 蛋白质的性质实验——蛋白质及氨基酸的 呈色反应 一、实验目的 1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。 2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。 3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。 双缩脲反应 二、实验原理 尿素加热至 180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。双缩脲在碱性环境中 能与 Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中有肽键， 其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。可用于蛋白质的定性或定量测定。 双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。含有一个肽键和一个—CS —NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH 或— CHOHCH2NH2等基团 NH2 NH2 的物质以及乙二酰二胺（O＝C——C＝O）等物质也有此反应。NH3 也干扰此反 应，因为 NH3与 Cu 2+可生成暗蓝色的络离子 Cu（NH3）4 2+。因此，一切蛋白质 或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或 多肽。 三、材料、仪器与试剂 尿素；10%氢氧化钠溶液；1%硫酸铜溶液；2%卵清蛋白溶液 四、实验操作 取少量尿素结晶，放在干燥试管中。用微火加热使尿素熔化。熔化的尿素 开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。冷后，加 10%氢氧化钠溶液 约 1ml，振荡混匀，再加 1%硫酸铜溶液 1 滴，再振荡。观察出现的粉红颜色。 要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。 向另一试管加卵清蛋白溶液约 1ml 和 10%氢氧化钠溶液约 2ml，摇匀，再 加 1%硫酸铜溶液 2 滴，随加随摇。观察紫玫瑰色的出现。 茚三酮反应 二、实验原理 除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一 切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质
β一丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪和 肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此,虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应,但 能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中,应 严防干扰物存在 该反应十分灵敏,1:1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应,是一种 常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步,第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,水合 茚三酮被还原成还原型茚三酮:第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚 酮分子和氨缩合生成有色物质 此反应的适宜pH为5-7,同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的 颜色深浅不同,酸度过大时甚至不显色。 三、材料、仗器与试剂 蛋白质溶液;2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液(蛋清:水=1:9);0.5%甘氨 酸溶液:;0.1%茚三酮水溶液;0.1%茚三酮-乙醇溶液 四、实验操作 ①取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液ml,再各加0.5ml0.1%茚 三酮水溶液,混匀,在沸水浴中加热1~2分钟,观察颜色由粉色变紫红色再变蓝 ②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液,风干后,再在原处滴一滴0.1% 茚三酮乙醇溶液,在微火旁烘干显色,观察紫红色斑点的出现。 黄色反应 二、实验原理 含有苯环结构的氨基酸,如酪氨酸和色氨酸,遇硝酸后,可被硝化成黄色物 质,该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸,所以有黄色反应,苯丙氨酸不易硝化, 需加入少量浓硫酸才有黄色反应。 三、材料、仪器与试剂 鸡蛋清溶液:大豆提取液;头发;指甲;0.5%苯酚溶液;浓硝酸:0.3%色 氨酸溶液:;0.3%酪氨酸溶液:10%氢氧化钠溶液 四、实验操作 向7个试管中分别按下表加入试剂,观察各管出现的现象,有的试管反应慢 可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后,于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶 液至碱性,观察颜色变化
15 β—丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。尿素、马尿酸、二酮吡唪和 肽键上的亚氨基不呈现此反应。因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但 能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应 严防干扰物存在。 该反应十分灵敏，1∶1 500 000 浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种 常用的氨基酸定量测定方法。 茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成 CO2、NH3 和醛，水合 茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚 三酮分子和氨缩合生成有色物质。 此反应的适宜 pH 为 5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同 pH 条件下的 颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。 三、材料、仪器与试剂 蛋白质溶液；2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）；0.5%甘氨 酸溶液；0.1%茚三酮水溶液；0.1%茚三酮-乙醇溶液 四、实验操作 ①取 2 支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液 1ml，再各加 0.5ml0.1%茚 三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热 1~2 分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。 ②在一小块滤纸上滴一滴 0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴 0.1% 茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。 黄色反应 二、实验原理 含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物 质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。 多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化， 需加入少量浓硫酸才有黄色反应。 三、材料、仪器与试剂 鸡蛋清溶液；大豆提取液；头发；指甲；0.5%苯酚溶液；浓硝酸；0.3%色 氨酸溶液；0.3%酪氨酸溶液；10%氢氧化钠溶液 四、实验操作 向 7 个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢 可略放置或用微火加热。待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入 10%氢氧化钠溶 液至碱性，观察颜色变化