实验三氨基酸分离——双向层析法 、实验目的 学习双向纸层析的原理和操作方法,进行混合氨基酸的分离分析。 二、实验原理 纸层析是以滤纸作支持物,用一定的溶剂系统展开,使混合样品达到分离分 析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中,点样在滤纸的一端;再 选用适当的溶剂系统,从点样的一端通过毛细现象向另一端展开,展开完毕,取 出滤纸晾干或烘干,再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经 展开后其一物质在纸层析谱上的位置常用比移值R来表示 原点至纸层析斑点中心点的距离 原点至溶剂前沿的距离 纸层析可看作是溶质(样品)在固定相与流动相之间的连续抽提,由于溶质 在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系 数,因而在恒定条件(液剂、P、温度)下,各物质有固定的R值,据此可达到 分析鉴定的目的。 由于滤纸纤维可吸收20~25%的水分;且其中6~7%以氢键形式与纤维素上 羟基结合,一般条件下难脱去;所以纸层析实际上是以水相作固定相,展开的溶 剂作流动相 纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般 用上行法。上行法又分单向(成分较为简单的样品)和双向(单向时斑点重叠分 离不开,于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层)。双相层析谱可分辨十几种 以上的样品。 层析滤纸要求: (1)质地均匀,平整无折痕,厚薄适当,溶剂能匀速展开。 (2)机械强度好,溶剂展开后能保持原状,不易折到。 (3)有一定纯度而少杂质,以免影响层析图谱背景。 (4)纤维松紧适宜,一般选用中速滤纸,或根据溶剂选择。如丁醇类粘度 大,宜用快速滤纸:而氯仿、石油醚展开快,宜用慢速滤纸 6
6 原点至溶剂前沿的距离 原点至纸层析斑点中心点的距离 实验三 氨基酸分离——双向层析法 一、实验目的 学习双向纸层析的原理和操作方法，进行混合氨基酸的分离分析。 二、实验原理 纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品达到分离分 析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，点样在滤纸的一端；再 选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细现象向另一端展开，展开完毕，取 出滤纸晾干或烘干，再以适当的显色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经 展开后其一物质在纸层析谱上的位置常用比移值 Rf来表示。 Rf = 纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽提，由于溶质 在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在两相间有固定的分配系 数，因而在恒定条件（液剂、PH、温度）下，各物质有固定的 Rf值，据此可达到 分析鉴定的目的。 由于滤纸纤维可吸收 20～25%的水分；且其中 6～7%以氢键形式与纤维素上 羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水相作固定相，展开的溶 剂作流动相。 纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基酸分离一般 用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双向（单向时斑点重叠分 离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种 以上的样品。 层析滤纸要求： （1）质地均匀，平整无折痕，厚薄适当，溶剂能匀速展开。 （2）机械强度好，溶剂展开后能保持原状，不易折到。 （3）有一定纯度而少杂质，以免影响层析图谱背景。 （4）纤维松紧适宜，一般选用中速滤纸，或根据溶剂选择。如丁醇类粘度 大，宜用快速滤纸；而氯仿、石油醚展开快，宜用慢速滤纸
层析溶剂要求: (1)被分离物质在该溶剂系统中R在0.05~0.8之间,各组分之R值相差 最好能大于0.05,以免斑点重叠。 (2)溶剂系统中任一组分与分离物之间不能起化学反应 (3)分离物质在溶剂系统中的分配较恒定,不随温度而变化,且易迅速达 到平衡,这样所得斑点较圆整 本实验采用八种混合氨基酸为样品,用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析, 以茚三酮为显色剂,可获得分离清晰的层析图谱。图谱示意如下 时…冖 原点 Ⅱ相正酶::9别乙醇:水=5:1:l:1 三、材料、仪器与试剂 (一)实验材料 标准氨基酸混合溶液:亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门 冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各100ng溶于50m10.01M盐酸中。 (二)仪器设备 层析缸25×40cm(×2);培养皿15cm(×2);喷雾器:毛细管内径0.lcm; 电吹风;烘箱。层析滤纸14×1lcm:;铅笔,尺。 (三)试剂 0.1%(w/V)茚三酮溶丙酮液; 溶剂系统:第一相:正丁醇:88%甲酸:水=15:3:2(V/V 第二相:正丁醇:吡啶:95%乙醇:水=5:1:1:1(V/)
7 层析溶剂要求： （1）被分离物质在该溶剂系统中 Rf在 0.05～0.8 之间，各组分之 Rf值相差 最好能大于 0.05，以免斑点重叠。 （2）溶剂系统中任一组分与分离物之间不能起化学反应。 （3）分离物质在溶剂系统中的分配较恒定，不随温度而变化，且易迅速达 到平衡，这样所得斑点较圆整。 本实验采用八种混合氨基酸为样品，用酸性和碱性两种溶剂进行双向层析， 以茚三酮为显色剂，可获得分离清晰的层析图谱。图谱示意如下： 三、材料、仪器与试剂 （一）实验材料 标准氨基酸混合溶液：亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天门 冬氨酸、组氨酸、丝氨酸各 100mg 溶于 50ml 0.01M 盐酸中。 （二）仪器设备 层析缸 25×40cm（×2）；培养皿 15cm（×2）；喷雾器；毛细管内径 0.1cm； 电吹风；烘箱。层析滤纸 14×11cm；铅笔，尺。 （三）试剂 0.1%（W/V）茚三酮溶丙酮液; 溶剂系统：第一相：正丁醇∶88%甲酸∶水＝15∶3∶2（V/V）； 第二相：正丁醇∶吡啶∶95%乙醇∶水＝5∶1∶1∶1（V/V）
四、实验操作 1.点样 取层析滤纸一张(14×11cm),在距纸边1.2cm处划一基线:再将纸转90° 距纸边1.2cm处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液,点与二线交 点处(见图4-1),点的直径控制在2mm左右,不可过大。待样品干燥后再点 次。滤纸上点样斑点干燥后,把滤纸卷成圆筒形,纸的两边以铬丝相连,但不可 重叠相碰 2.展层 在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入, 点样一段接触溶剂,以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开,约2 小时后溶剂到达距纸边0.5cm处取出滤纸,悬挂于室温中,以电吹风充分吹尽溶 剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘,将滤纸转90°,卷成如前圆筒状,放入 盛第二相溶剂的层析缸内展开(操作同上),约1小时后溶剂展开到距纸边0.5cm 时取出,以电吹风吹尽溶剂使其干燥。 溶剂前沿 溶剂1 点样 结果 溶剂2 转90°裁去溶 剂前沿部分 单向上行 双向上行 纸层析点样、展层 (X,Y分别为云点至斑点中心和溶剂前沿的距离,x为点样原点) 3.显色 以喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上,然后悬滤纸于65℃烘箱内加热20分 钟,即可看到紫红色氨基酸斑点,将图谱上的斑点用铅笔圈出
8 四、实验操作 1.点样 取层析滤纸一张（14×11cm），在距纸边 1.2cm 处划一基线；再将纸转 90°， 距纸边 1.2cm 处作一线与上线垂直。以毛细管吸取混合氨基酸溶液，点与二线交 点处（见图 4-1），点的直径控制在 2mm 左右，不可过大。待样品干燥后再点一 次。滤纸上点样斑点干燥后，把滤纸卷成圆筒形，纸的两边以铬丝相连，但不可 重叠相碰。 2.展层 在层析缸中平稳的放入装有第一相层析溶剂的培养皿。将圆筒形滤纸放入， 点样一段接触溶剂，以点样处不浸入溶剂为准。待溶剂自下而上均匀展开，约 2 小时后溶剂到达距纸边 0.5cm 处取出滤纸，悬挂于室温中，以电吹风充分吹尽溶 剂。然后裁去未走过溶剂的滤纸边缘，将滤纸转 90°，卷成如前圆筒状，放入 盛第二相溶剂的层析缸内展开（操作同上），约 1 小时后溶剂展开到距纸边 0.5cm 时取出，以电吹风吹尽溶剂使其干燥。 3.显色 以喷雾器将茚三酮均匀地喷在滤纸上，然后悬滤纸于 65℃烘箱内加热 20 分 钟，即可看到紫红色氨基酸斑点，将图谱上的斑点用铅笔圈出。 纸层析点样、展层 （X, Y 分别为云点至斑点中心和溶剂前沿的距离，x 为点样原点）
五、注意事项 (1)烘箱加热温度不可过高,且不可有氨的干扰,否则图谱背景会泛红 2)第一相溶剂最好在使用前再按比例混合,否则会引起酯化影响层析效果。 (3)接触滤纸时,要戴手套。 六、思考题: 1.酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响? 为什么展层时要用两种溶剂系统?
9 五、注意事项 （1）烘箱加热温度不可过高，且不可有氨的干扰，否则图谱背景会泛红。 （2）第一相溶剂最好在使用前再按比例混合，否则会引起酯化影响层析效果。 （3）接触滤纸时，要戴手套。 六、思考题： 1．酸性与碱性溶剂系统对氨基酸极性基团的解离各有何影响？ 2．为什么展层时要用两种溶剂系统？
实验四样品中总氮量的测定—微量凯氏定氮法 、实验目的 1.掌握凯氏定氮仪的使用方法 2.掌握凯氏定氮法测定样品总氮量的原理。 、实验原理 1.什么是凯氏定氮法?有什么意义? 大多数蛋白质中氮的含量较恒定,平均为16%,即每100g蛋白质中含16g 氮,因此可通过测定生物样品中的氮来测定蛋白质的含量(每测得1g氮即相当 于6.25g蛋白质)。这是定氮法测定蛋白质含量的计算基础,即用定氮法测得的 样品含氮量乘以6.25,即可算出样品中蛋白质的含量。蛋白质含量=含氮量× 6.25,测定蛋白质含量的方法很多,其中最基本和常用的方法就是测定含氮量的 方法。测定含氮量一般都采用微量凯氏定氮法。 2.该方法原理? 蛋白质样品先经浓硫酸加热消化,使蛋白质中的有机氮转变成为无机氮,然 后经碱化蒸馏,放出的氨气用标准酸吸收,再用标准碱来滴定剩余的酸,计算出 的含氮量乘以6.25即是该样品中的蛋白质含量。 三、材料、仪器与试剂 (一)实验材料:市售面粉 (二)仪器设备(仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案 后教师审定) 凯氏烧瓶;凯氏定氮蒸馏装置;容量瓶;微量滴定管;烘箱;电炉;1000 毫升蒸馏烧瓶;小玻璃珠或毛细管;电子天平 (三)试剂(试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教 师审定后并配制) 浓硫酸(AR);硫酸铜;硫酸钾混;甲基红乙醇;溴甲酚绿乙醇;棚酸:乙 醇;氢氧化钠; 四、实验操作 1.凯氏定氮仪的构造和安装:
10 实验四 样品中总氮量的测定——微量凯氏定氮法 一、实验目的 1.掌握凯氏定氮仪的使用方法； 2.掌握凯氏定氮法测定样品总氮量的原理。 二、实验原理 1.什么是凯氏定氮法？有什么意义？ 大多数蛋白质中氮的含量较恒定，平均为 16％，即每 100g 蛋白质中含 16g 氮，因此可通过测定生物样品中的氮来测定蛋白质的含量（每测得 1g 氮即相当 于 6.25g 蛋白质）。这是定氮法测定蛋白质含量的计算基础，即用定氮法测得的 样品含氮量乘以 6.25，即可算出样品中蛋白质的含量。蛋白质含量＝含氮量× 6.25，测定蛋白质含量的方法很多，其中最基本和常用的方法就是测定含氮量的 方法。测定含氮量一般都采用微量凯氏定氮法。 2.该方法原理？ 蛋白质样品先经浓硫酸加热消化，使蛋白质中的有机氮转变成为无机氮，然 后经碱化蒸馏，放出的氨气用标准酸吸收，再用标准碱来滴定剩余的酸，计算出 的含氮量乘以 6.25 即是该样品中的蛋白质含量。 三、材料、仪器与试剂 （一）实验材料：市售面粉 （二）仪器设备 （仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案 后教师审定） 凯氏烧瓶；凯氏定氮蒸馏装置；容量瓶；微量滴定管；烘箱；电炉；1000 毫升蒸馏烧瓶；小玻璃珠或毛细管；电子天平。 （三）试剂 （试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教 师审定后并配制） 浓硫酸（AR）；硫酸铜；硫酸钾混；甲基红乙醇；溴甲酚绿乙醇；棚酸；乙 醇；氢氧化钠； 四、实验操作： 1．凯氏定氮仪的构造和安装：