第二十一章细胞增殖与细胞周期 学习目标 通过本章学习，你应该能够： 掌握细胞周期的概念和主要事件，细胞周期的调控机制。 熟悉细胞分裂的类型和特点。 了解 细胞周期与疾病的关系。 细胞增殖是细胞生命活动的基本特征，是生物个体生长、发育、繁殖和遗传的基础。细胞增殖包 细胞的生长、DNA复制及细胞分裂。通过细胞分裂，可以将复制的遗传物质，平均的分配到两个子细胞 中去。单细胞生物以细胞分裂方式产生新的个体；多细胞生物是由一个受精卵经过无数次细胞分裂，分 化、发育为成体。在细胞增殖的D八A复制和细胞分裂过程中，是通过细胞周期来实现的。细胞周期是 细胞物质积累与细胞分裂的循环过程，细胞周期进程严格受周期蛋白（©yci)与周期蛋白依赖性激酶 (cyelin-dependent kinase,Cdk)的调控，细胞周期不同时相的cyelin-Cd复合物是调控细胞周期进程的 核心。在一定生理条件下，各个组织器官细胞的增殖受多个因素的调控，按照一定规律进行，实现个体 的生长和发育。 第一节细胞周期的基本概念 生命是一个代代相传、不断更新的连续过程，生命的延续和繁衍都是以细胞的生长和增殖为基础 的。细胞增殖(cell proliferation)是有机体生命活动的一个重要特征，指细胞通过生长和分裂产生子代 细胞，使得细胞数目增加，并使子代细胞获得同母细胞相同遗传特性的过程。 一、细胞周期概念和意义 细胞通过周而复始的分裂，数量不断增加。从上一次细胞分裂结束开始到下一次细胞分裂结束所 经历的整个过程称为细胞周期(cell©ycle)。细胞周期的长短反映了细胞所处的状态，是细胞物质积累 与细胞分裂的循环过程。通常情况下，细胞周期划分为分裂间期和分裂期，分裂间期是物质准备和积 阶段，包括DNA合成前期(G,期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G,期)：分裂期(M期)则是细胞 增殖的实施过程。长期以来，细胞周期一直是一个重要的研究领域。这不仅因为细胞周期是生命的基 础，而且很多医学问题，如机体的生殖、再生和修复、肿瘤发生与治疗等，都与细胞周期有密切的关系。 研究细胞周期及其调控机制，无论对于了解人体的正常生命活动，还是对医学基础理论和实践都具有重 要意义。 人类认识细胞周期的历史可以追溯到1841年，当时R©mark报道了鸡胚血细胞的直接分裂，并认为 486
第二十一章细胞增殖与细胞周期 细胞分列是机体生长发育的根本动力。1855年.德国病理学家Virchow提出著名的论断：一切细胞来自 细胞。1880年F1 emming和Strasburger发现动物细胞的间接分裂，并命名为有丝分裂。1953年DNA双 螺旋模型提出以后，分子生物学得到迅速的发展，逐渐阐明了DNA的复制、基因表达、信号转导等一系 列重要的细胞机制，使人们对细胞周期的认识深人到分子层次。Howard和Plc在1951年至1953年提 出和建立了细胞周期四个时相的概念。20世纪60年代至80年代，Hartwell、Hunt和Nurse对细胞周期 调控的分子机制进行了开创性的研究，并因此获得了2001年诺贝尔生理学或医学奖。Hartwell以芽殖 酵母为研究材料，用遗传突变方法筛选出大量细胞周期调控基因，并提出细胞周期检控点概念：Hut通 过观察海胆胚胎细胞中一种新蛋白质的周期性浓度变化，提出周期蛋白的合成和降解决定了细胞分裂 的开始和结束；Nurse在裂殖酵母细胞中找到了细胞周期中最重要的蛋白激酶Cdc2(即Cd1),并发现 它必须与周期蛋白结合才具有活性。 尽管已经取得了大量的研究成果，但是研究人员对于细胞周期的认识仍然很不完整。随着人类基 因组计划、后基因组计划及蛋白质组计划的发展和完成，人们开始对细胞周期的基因表达和调控网络进 行大规模的定量分析，为细胞周期的研究提供了许多新的资料，也推动了细胞周期研究的进一步发展。 二、细胞周期的研究 细胞种类繁多，不同类型的细胞增殖速度有所差异，细胞周期长短差别也很大。细胞在增殖受阻时 会离开细胞周期，进人休眠期，即G。期。G。期细胞受到适当的刺激后，可以重返细胞周期，也可以转变 为不能再分裂的终末分化细胞，或启动细胞调亡。人体的大部分细胞是终末分化细胞，如神经细胞、开 细胞和红细胞：肝、肾等器官实质细胞属于G期细胞；各种干细胞则属于连续增殖细胞。 人体细胞在总 体上处于增殖、分化和衰老的动态平衡中，使组织器官得到稳定的更新和发育。细胞增殖不足将导致贫 血、免疫功能低下、组织器宫退化等病变，细胞增殖失控则引起肿瘤，因此，细胞增殖的调控直接影响到 细胞的生长与发育，并参与多种疾病的发生。 〔一】细胞周期模型 细胞周期研究常用的模型包括芽殖酵母、裂殖酵母、爪蟾胚胎细胞和体外培养的哺乳动物细胞。 以酵母作为细胞周期研究的模型，其优点是细胞周期机制较为原始，基因组简单，便于遗传操作。 芽殖酵母是第一个完成基因组测序的真核生物，基因组全长1.2×10'bp,只有24个内含子，基因总数大 约为6000个。目前已经较全面地完成了芽殖酵母的基因敲除、蛋白质相互作用、全蛋白质组测定、细胞 周期基因表达以及转录因子的染色体定位等功能基因组学实验，为全面分析酵母的细胞周期提供了丰 富而系统的数据 爪蟾胚胎细胞的特点是体积大，分裂快，有利于分析基本的细胞周期调控机制。爪蟾卵细胞的直径 约为1mm,不仅便于观察，而且便于进行细胞注射和核移植等操作。此外，利用爪蟾胚细胞的抽提物 还可以建立非细胞的周期时相系统。 （一)细胞同步化 细胞周期研究中常常需要设法使培养细胞都处于同一时相，这就是细胞的同步化。细胞同步化的 方法很多，从原理上大致可分为两类：诱导同步法和选择同步法。 诱导同步法是在培养液中添加或去除某些成分，或者改变培养温度，从而对细胞的生长进行阻滞或 恢复，将不同步生长的细胞调整为同步生长，获得时相较为均一的细胞群体，如用秋水仙素使M期细胞 停止在中期，就可用来进行染色体分析。选择同步法是根据细胞的体积、粘附性等的时相特征来对不同 时相的细胞进行选择和分离，从而实现细胞的同步化。 1.细胞分裂收获法进行动物细胞单层培养时，在细胞不分裂的时候，都贴附在瓶壁表面。当有 丝分裂开始，细胞形状成圆球形。这时如把瓶轻轻摇动，正在分裂的细胞就被摇下来。这样，每隔1小时 摇一次并收获一次，放人2一4℃冰箱保存，可以连续收集24小时。待收集完毕，再放入加有适量秋水仙素 的培养液中，在37℃温箱中培养，处于M期的细胞马上就可以开始生长，并都停留在中期（图21-1）。 487
第玉黄想胞分梨增殖与生长发育 2.代谢抑制法该法常用的药物是加过量的胸苷到 培养液中。胸苷是合成DNA的前体，是不可缺少的。适当 入来能头限 的量为10’-10'mol/L,如给以过量的胸苷(103mol/L) 则将引起脱氧胸苷的合成受到抑制，结果DNA的合成 也将受到阻止，加一次过量的胸苷继续培养，则细胞大 都被阻滞在G,/S期。经过清洗就可把多余的胸苷洗掉 而得到同步化的细跑。如这时环不能充分同步，可再 次加人过量的胸苷处理。 该法是先将细胞在37℃中培养 分析绕的 3.低温培养法 24小时，然后在4℃培养1小时，并很快回到37℃中继 续培养。在其后17小时内几乎没有看到分裂，但再经 1小时，约有95%的细胞同时进行分裂，细胞的数目增 加1倍。如果保持这种同步分裂，可将分裂后的细胞再 图21细胞分裂收获法收集M期细胞 经过一次低温处理。 (三)细胞周期时间的测定 细胞周期时间的长短因细胞的类型、状态和环境而有所差异。例如，对同样的酵母进行培养，个体 的增殖谏率可相差2倍以上：改变培养条件，酵母的平均细胞周期时间为1一7小时：就人体细胞而言 如神经细胞、血细胞、肌细胞、肝细胞等不同类型细胞的细胞周期，其生长繁殖速度差异很大，短的有几 十分钟、几小时：长的则需要几个月甚至十几年。 细胞周期的研究工作中常常会涉及到细胞周期时间的测定，方法有很多种，目前最常用的是采用流 式细胞仪(flow cyto meter,FCM)测定和分析细胞周期各个时相G,期、S期、G,期和M期的细胞数目和分 布情况。流式细胞仪是对细胞进行自动分析和分选的装置。它可以快速测量悬浮在液体中的分散细胞 的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预洗的参量范围把指定的细胞亚群从 中分选出来。研究者从细胞的DNA含量人手，G,期、G,/M期细胞都含有固定的DNA含量，S期细胞的 DNA含量介于G,期和G,/M期之间，因此，流式细胞仪可以通过监察细胞DNA含量在不同时间内的变 化，确定细胞周期时间的长短。 第二节细胞周期的主要事件 细胞周期可以划分为DNA合成前期(G,期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G,期)和分裂期 (M期)4个时相，其中DNA合成前期、DNA合成期与DNA合成后期属于分裂间期。细胞在分裂间期进 行DNA复制、组蛋白、非组蛋白的合成、分裂期所需其他蛋白质的合成等若干分子事件，为细跑进入分 裂期做好准备。细胞在每个时相会发生许多不同的分子事件，这些事件相互协调、共同调控着细胞的分 裂和增殖。 一、G期 G,期是细胞周期的第一阶段，即DNA合成前期，这一时期主要的特点表现为RNA大量合成，蛋白 质含量明显增加。S期所需要的DNA复制相关的酶系如DNA聚合酶，及G,期向S期转变所需要的蛋 白质如触发蛋白、钙调蛋白、细胞周期蛋白等均在G,期合成。触发蛋白对于细胞从G,期进人S期是必 需的，只有当其含量积累到临界值，细胞周期才能朝DNA合成方向进行。钙调蛋白是真核细胞内重要 的Ca受体，其活性受C浓度调节，钙调蛋白的含量，在G,晚期可以达到峰值，用抗钙调蛋白药物处 理细胞，可以延缓细胞从C,期到S期的进程。蛋白质的磷酸化作用在G,期也较为突出。组蛋白的磷酸 488
第二十一章细胞增殖与细胞周期 化在G,期开始增加，这将有利于G,晚期染色体结构成分的重排 在G,期的晚期阶段有一个特定时期，在直核细胞中，这一特定时间点称为限制点(restriction point R点)成检杏点(checkpoint),如果细胞通时这一限制点，将讲人S期.开始合成DNA,并继续向前直到 完成细胞分裂。研究表明限制点是G期进人G,期的一个检查点，也是哺乳动物细胞周期G,期控制进 入S期的调节点。细胞周期的调节主要是通过G,期的阻留而实现的，停止在G,期的细胞称为休止细胞 或G,期细胞。细胞通过M期一分为二，有的可以继续分裂进行周期循环，有的则转人G。期。G。期是脱 离细胞周期暂时停止分裂的一个阶段。但在一定适宜刺激下，又可进入周期，合成DNA与分裂。G,期 的特点为：①在未受刺激的G细胞DNA合成 与细胞分裂的潜力仍然存在：②当G,细胞受 限制点(R点】 到刺激而增殖时，又能合成DNA并进入周期， 继续进行细胞分裂。研究证明，哺乳动物细 胞体外培养时，需要添加多肽生长因子促进 细胞的分裂。如果缺少生长因子，就会被用 止在G,阶段，一旦在培养基中添加了生长因 细胞周期 子，这些细胞在14~16小时后通过细胞周期 限制点，进入S期，并完成余下的细胞周期 过程。 同时，限制点也是G,期晚期一个基本事 因组复 件，只有完成这一基本事件的真核细胞，才能 有丝分裂期 顺利通过G,期，进入S期并合成DNA。如果 细胞不能完成这一基本事件，将影响细胞从 纺锤体组装 G,明向S期的转变。影响这一事件的内在因 C期检查点 素句括一些与细胞分裂基因调控时程相关的 图212细胞周期各个时相主要分子事件（示G。期细胞） 因素；外在因素包括营养供给和相关的激素 刺激等，细胞只有在所需的内在因素和外在因素的共同作用下，才能通过限制点，顺利进入S期并完成 后续的分裂过程（图212） 二、S期 S期即DNA合成期，是细胞进行大量DNA复制的阶段，组蛋白及其非组蛋白也在此期大量 合成。DNA复制的起始和复制过程受到多种细胞周期调节因素的严格控制和调节。细胞能否通 过S期进入G,期将受到S期检查点的控制，S期检查点的生物学功能是检测细胞内存在的DNA损 伤并阻断DNA复制的继续进行，一旦细胞通过S期检查点，就可以顺利进入G,期，完成后续的细胞 分裂 DNA的复制需要多种酶的参与，包括DNA聚合酶、DNA连接酶、胸腺嘧啶核苷激酶、核苷酸还原酰 等。随着细胞由G,期进入S期，这些酶的含量或活性可显著增高。DNA复制具有严格的时间顺序性 通常CC含量较高的DNA序列在早S期复制，而晚S期复制的主要为AT含量较高的DNA序列；就染 色体而言，常染色质的复制较异染色质要早。同时，S期也是组蛋白合成的主要时期，此时胞质中出现 大量的组蛋白mRNA,新合成的组蛋白从细胞质进入细胞核，与复制后的DNA迅速结合，组装成核小 体，进而形成具有两条染色单体的染色体。除了组蛋白合成以外，在$期细胞中还进行着组蛋白持续的 磷酸化。中心粒的复制也在S期完成。原本相互垂直的一对中心粒发生分离，各自在其垂直方向形成 一个子中心粒，由此形成的两对中心粒在以后的细胞周期进程中，将发挥微管组织中心的作用，纺锤体 微管、星体微管的形成均与此相关。 489
第五篇细胞分裂增殖与生长发育 三、G,期 DNA复制完成以后，细胞将进入G,期，即DNA合成后期。这时细胞核内DNA含量增加一倍，每条 染色体含有2倍的DNA,进人G,期的细胞为进入M期做好准备 细胞中将合成一些与M期结构、功能相关的蛋白质，与核膜破裂、染色体凝集密切相关的成熟促进 因子即在此期合成。微管蛋白在G,期合成达到高峰，为M期纺锤体微管的形成提供了丰富的来源。已 复制的中心粒在G,期逐渐长大，并开始向细胞两极分离。 细胞能否进人M期，将受到G,期检查点的控制，G,期检查点的功能是阻止带有DNA损伤的细胞进 人M期，检查D八NA损伤是否完成修复，确保细胞基因组的完整性和稳定性。只有通过G,期检查点的细 胞才可以进入M期，完成细胞分裂。 四、M期 M期即有丝分裂期。在此期细胞中，染色体凝集后发生姐妹染色单体的分离，核膜，核仁破裂后再 重建，胞质中有纺锤体、收缩环出现，随着两个子细胞核的形成，胞质也一分为二，由此完成细胞分裂，包 括核分裂和胞质分裂。真核细胞的分裂方式包括无丝分裂、有丝分裂和诚数分裂，体细胞一般进行有丝 分裂，生殖细胞成熟过程中则进行减数分裂。 在有丝分裂期，除非组蛋白外，细胞中蛋白质合成显著降低。RNA的合成在M期侧完全被抑制。 第三节细胞分裂 随着生物的进化，细胞分裂也是由简单到复杂并趋于完善。原核细胞的分裂简单而迅速，是通过细 胞直接分裂而把细胞分成两等分，从而产生子代。真核细胞因其结构复杂，出现了膜性细胞器，从而出 现了以下三种分裂方式，即无丝分裂、有丝分裂和减数分裂。 无丝分裂 无丝分裂(amitosis)是指细胞直接分裂成两个大小大致相等的子细胞。在无丝分裂过程中没有染 色体的组装及纺锤体的形成，也无核膜、核仁的消失重建及细胞核的变化，故又称直接分裂(dir©et divi sion 无丝分裂最早是1841年由Remak在鸡胚血细胞中发现的，由于在分裂过程中没有纺锤体和染色 体的变化，在1882年由F】emming提出无丝分裂的概念。 细胞进行无丝分裂时，细胞体积增长，细胞核逐渐伸长呈哑铃型，中央部分变细断开。细胞中部缢 缩、变细、断裂，最终分成两个细胞。无丝分裂常见于高等动物迅速分裂的器官组织、创伤修复（伤口附 近)、体外培养细胞、病理性代偿情况下。因此，有人认为，无丝分裂是有机体对生理或病理需要的“应 急”反应。无丝分裂的细胞具有分裂迅速、能量消耗少、分裂中细胞仍可以继续执行其功能等特点，使 得无丝分裂对于细胞适应外界环境变化，有着特殊意义。 二.有丝分分奥 有丝分裂(mitosis)又称为间接分裂(indirect division)。它包括核分裂(carvokinesis)和跑质分裂 (cytokinesis)两个过程。首先核分裂，之后为胞质分裂。有丝分裂最早由lemming(1882)在红细胞和 蝾螈的上皮细胞中发现。 有丝分裂是真核细胞的主要增殖方式。在有丝分裂过程中，细胞核的形态会发生一系列的变化并 出现了专门执行细胞分裂的有丝分裂器(mitotic apparatus),将复制好的遗传物质平均分配给两个子细 490