第九章血清（浆）脂类及脂蛋白测定血清(浆)脂类简称血脂。其成分主要包括有甘油三酯、胆固醇、胆固醇酯、磷脂、糖脂游离脂肪酸等，均以溶解度较大的脂蛋白复合体形式存在于血液中，血浆脂蛋白根据密度不同分为高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(lowdensity lipoproteinLDL)、极低密度脂蛋白(verylowdensitylipoproteinVLDL)、乳糜微粒(chylomicrons,CM)等；载脂蛋白是血浆脂蛋白的蛋白质部分，各类脂蛋白中均含有一种或几种不同的特异性载脂蛋白。血脂测定可及时地反映体内脂类代谢状况，也是临床常规分析的重要指标。在临床上，对这些成分的检测由来已久，就方法学而言有化学法、酶法、免疫化学比浊法、电泳法、超速离心法等。本章根据教学和临床实际需要，介绍一般常用的基础检测方法，并就方法学的优缺点、发展趋势进行简要评价。第一节血清甘油三酯的测定甘油三酯(triglyceride,TG)的测定分为化学法和酶法。化学法可使用正庚烷-异丙醇混合溶剂等从血清中抽提出甘油三酯，再经过皂化、氧化，由显色反应进行测定。乙酰丙酮显色法是目前常用的化学法。酶法测定甘油三酯具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点，适用于手工和自动化测定。实验48乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯【原理】血清甘油三酯经过正庚烷-异丙醇混合溶剂抽提，用氢氧化钾皂化生成甘油，在过碘酸的作用下甘油被氧化为甲醛，当有铵离子存在时，甲醛和乙酰丙酮发生缩合反应生成带荧光的黄色物质即3，5-二乙酰-1，4二氢二甲基吡啶(Hantgsch反应)，反应液的颜色深浅与TG浓度成正比。【试剂】1.抽提液正庚烷(AR)和异丙醇(AR)以4：7(V/V)比例混合均匀。2.40mmol/LH2SO4溶液浓硫酸2.24ml(根据比重和百分含量而定)加蒸馏水稀释至1000 ml。3.皂化剂称取氢氧化钾6.0g溶于蒸馏水60ml中，再加异丙醇40ml，混匀后置棕色
1 第九章 血清（浆）脂类及脂蛋白测定 血清(浆)脂类简称血脂。其成分主要包括有甘油三酯、胆固醇、胆固醇酯、磷脂、糖脂、 游离脂肪酸等，均以溶解度较大的脂蛋白复合体形式存在于血液中，血浆脂蛋白根据密度不 同分为高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)、乳糜微粒(chylomicrons, CM)等； 载脂蛋白是血浆脂蛋白的蛋白质部分，各类脂蛋白中均含有一种或几种不同的特异性载脂蛋 白。血脂测定可及时地反映体内脂类代谢状况，也是临床常规分析的重要指标。在临床上， 对这些成分的检测由来已久，就方法学而言有化学法、酶法、免疫化学比浊法、电泳法、超 速离心法等。本章根据教学和临床实际需要，介绍一般常用的基础检测方法，并就方法学的 优缺点、发展趋势进行简要评价。 第一节 血清甘油三酯的测定 甘油三酯(triglyceride, TG)的测定分为化学法和酶法。化学法可使用正庚烷-异丙醇混合溶 剂等从血清中抽提出甘油三酯，再经过皂化、氧化，由显色反应进行测定。乙酰丙酮显色法 是目前常用的化学法。酶法测定甘油三酯具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点，适用 于手工和自动化测定。 实验 48 乙酰丙酮显色法测定血清甘油三酯 【原理】 血清甘油三酯经过正庚烷-异丙醇混合溶剂抽提，用氢氧化钾皂化生成甘油， 在过碘酸的作用下甘油被氧化为甲醛，当有铵离子存在时，甲醛和乙酰丙酮发生缩合反应生 成带荧光的黄色物质即 3，5-二乙酰-1，4-二氢二甲基吡啶(Hantgsch 反应)，反应液的颜色深 浅与 TG 浓度成正比。 【试剂】 1．抽提液 正庚烷(AR)和异丙醇(AR)以 4：7(V/V)比例混合均匀。 2．40 mmol/L H2SO4 溶液 浓硫酸 2.24 ml (根据比重和百分含量而定)加蒸馏水稀释至 1 000 ml。 3．皂化剂 称取氢氧化钾 6.0 g 溶于蒸馏水 60 ml 中，再加异丙醇 40 ml，混匀后置棕色
瓶中室温保存。4.氧化剂称取过碘酸钠65mg，溶于蒸馏水约50ml中，再加入无水醋酸铵7.7g，溶解后加冰醋酸6ml，最后加蒸馏水至100ml，置棕色瓶中室温保存。5.显色剂取乙酰丙酮0.4ml加到异丙醇100ml中，混匀后置棕色瓶室温保存。6.三油酸甘油酯标准液2.26mmol/L(200mg/d1）准确称取三油酸甘油酯(平均分子量：885.4)200mg，溶于抽提剂，以100ml容量瓶定容，分装后置4℃冰箱保存。【操作步骤】按表9-1依次加入各物质。表9-1乙酰丙酮显色法测定甘油三酯的操作步骤加入物空白管测定管标准管血清(ml)0.2 0.2.标准液(ml)-0.2蒸馏水(ml)2.5 2.5 2.5抽提剂(ml)0.5 0.540mmo/L H2SO4(ml)0.5边加边摇，使之充分混匀，静置分层后，分别准确吸取上清液于另外3支试管中上清液(ml)0.3 0.3 0.3 1.01.0皂化剂(ml)1.0加入皂化剂后，充分混匀各管，56℃水浴保温5min，然后再分别加入下列试剂氧化剂(ml)1.01.01.01.0显色剂(ml)1.01.0加试剂后充分混匀各管，56℃水浴保温25min，取出冷却，用分光光度计比色，于415nm波长处，以空白管调零，测出各管的吸光度。【计算】测定管吸光度血清 TG(mmol/L)=X标准液浓度标准管吸光度【参考范围】血清TG正常范围：0.55~1.70mmol/L；临界阅值：2.30mmol/l：危险阅值：4.50mmol/L。2
2 瓶中室温保存。 4．氧化剂 称取过碘酸钠 65 mg，溶于蒸馏水约 50 ml 中，再加入无水醋酸铵 7.7 g，溶 解后加冰醋酸 6 ml，最后加蒸馏水至 100 ml，置棕色瓶中室温保存。 5．显色剂 取乙酰丙酮 0.4 ml 加到异丙醇 100 ml 中，混匀后置棕色瓶室温保存。 6．三油酸甘油酯标准液 2.26 mmol/L (200 mg/d1) 准确称取三油酸甘油酯(平均分子量： 885.4)200 mg，溶于抽提剂，以 100 ml 容量瓶定容，分装后置 4℃冰箱保存。 【操作步骤】 按表 9-1 依次加入各物质。 表 9-1 乙酰丙酮显色法测定甘油三酯的操作步骤 加入物 空白管 标准管 测定管 血清(ml) － － 0.2 标准液(ml) － 0.2 － 蒸馏水(ml) 0.2 － － 抽提剂(ml) 2.5 2.5 2.5 40mmol/L H2SO4(ml) 0.5 0.5 0.5 边加边摇，使之充分混匀，静置分层后， 分别准确吸取上清液于另外 3 支试管中 上清液(ml) 0.3 0.3 0.3 皂化剂(ml) 1.0 1.0 1.0 加入皂化剂后，充分混匀各管，56℃水浴保温 5min， 然后再分别加入下列试剂 氧化剂(ml) 1.0 1.0 1.0 显色剂(ml) 1.0 1.0 1.0 加试剂后充分混匀各管，56℃水浴保温 25 min，取出冷却，用分光光度计比色，于 415 nm 波长处，以空白管调零，测出各管的吸光度。 【计算】 血清 TG(mmol/L)＝ 标准管吸光度 测定管吸光度 × 标准液浓度 【参考范围】 血清 TG 正常范围：0.55～1.70mmol/L；临界阈值：2.30mmol/l；危险阈 值：4.50mmol/L
【临床意义】1.血清TG增高常见于家族性脂类代谢紊乱、肾病综合征、糖尿病、甲状腺功能减退急性胰腺炎、糖原积累病、胆道梗塞、原发性甘油三酯增高症、动脉粥样硬化等2．血清TG降低比较少见，慢性阻塞性肺疾患、脑梗死、甲状腺功能亢进、营养不良和消化吸收不良综合征等可引起血清TG的降低。【注意事项】1．血清TG易受饮食的影响，在进食脂肪后可以观察到血清中甘油三酯明显上升，2~4h内即可出现血清混浊，8h以后接近空腹水平。因此，要求空腹12h后再进行采血，并要求72h内不饮酒，否则会使检测结果偏高。2．显色后吸光度随时间延长会有一定量的增高，故加样后要立即比色，当标本过多时，可置冰箱中逐管进行比色3.本方法所用试剂较稳定，室温下可保存半年，分装使用可避免因试剂污染而引起的空白值升高。4．皂化、氧化及显色的时间和温度对吸光度均会有影响，所以每测定一批都应该同时做标准对照。5.TG在12.93mmo/L以下时，线性关系良好，当血清明显混浊时，可用生理盐水作倍比稀释后再测。6.以血浆作标本时，还应注意抗凝剂的影响，通常使用EDTAK2(1mg/ml)作抗凝剂。7.无论是使用血浆还是使用血清作为检测标本，取血后都应及时分离，以免红细胞膜磷脂在磷胎酶的作用下产生游离甘油(free glycerol，FG)，或者抗凝剂存在时红细胞内水溢出而稀释血浆降低TG值。分离血浆前，标本最好放于冰水中，并尽快分离血浆，避免TG自发水解出现误差。【评价】本方法测定范围较宽，在0.28～12.93mmol/L之间，具有良好的线性关系，回收率为100.4%～117.3%，批内变异系数为2.49%，批间变异系数为2.18%，符合临床检验方法学的要求。甘油被过碘酸氧化成甲醛的反应是非特异的，血清中磷脂、葡萄糖、游离甘油等也会被非特异地氧化，本实验方法中采用了分溶抽提，TG分配在正庚烷相中，而磷脂等则分配在异丙醇-水相中，提高了反应的特异性。实验 49磷酸甘油氧化酶法测定血清甘油三酯U
3 【临床意义】 1．血清 TG 增高常见于家族性脂类代谢紊乱、肾病综合征、糖尿病、甲状腺功能减退、 急性胰腺炎、糖原积累病、胆道梗塞、原发性甘油三酯增高症、动脉粥样硬化等。 2．血清 TG 降低比较少见，慢性阻塞性肺疾患、脑梗死、甲状腺功能亢进、营养不良和 消化吸收不良综合征等可引起血清 TG 的降低。 【注意事项】 1．血清 TG 易受饮食的影响，在进食脂肪后可以观察到血清中甘油三酯明显上升，2～ 4h 内即可出现血清混浊，8h 以后接近空腹水平。因此，要求空腹 12h 后再进行采血，并要求 72h 内不饮酒，否则会使检测结果偏高。 2．显色后吸光度随时间延长会有一定量的增高，故加样后要立即比色，当标本过多时， 可置冰箱中逐管进行比色。 3．本方法所用试剂较稳定，室温下可保存半年，分装使用可避免因试剂污染而引起的空 白值升高。 4．皂化、氧化及显色的时间和温度对吸光度均会有影响，所以每测定一批都应该同时做 标准对照。 5．TG 在 12.93mmol/L 以下时，线性关系良好，当血清明显混浊时，可用生理盐水作倍 比稀释后再测。 6．以血浆作标本时，还应注意抗凝剂的影响，通常使用 EDTAK2(1 mg/ml)作抗凝剂。 7．无论是使用血浆还是使用血清作为检测标本，取血后都应及时分离，以免红细胞膜磷 脂在磷脂酶的作用下产生游离甘油(free glycerol，FG)，或者抗凝剂存在时红细胞内水溢出而 稀释血浆降低 TG 值。分离血浆前，标本最好放于冰水中，并尽快分离血浆，避免 TG 自发 水解出现误差。 【评价】 本方法测定范围较宽，在 0.28～12.93 mmol/L 之间，具有良好的线性关系， 回收率为 100.4%～117.3%，批内变异系数为 2.49%，批间变异系数为 2.18%，符合临床检验 方法学的要求。 甘油被过碘酸氧化成甲醛的反应是非特异的，血清中磷脂、葡萄糖、游离甘油等也会被 非特异地氧化，本实验方法中采用了分溶抽提，TG 分配在正庚烷相中，而磷脂等则分配在异 丙醇-水相中，提高了反应的特异性。 实验 49 磷酸甘油氧化酶法测定血清甘油三酯
【原理】血清中甘油三酯经脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)作用，可以水解为甘油和游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)，甘油在ATP和甘油激酶(glycerokinase，GK)的作用下，生成3-磷酸甘油，再经磷酸甘油氧化酶(glycerophosphateoxidase，GPO)作用氧化生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢(H2O2),H2O,与4-氨基安替比林(4-AAP)及4-氯酚在过氧化物酶(peroxidasePOD)作用下，生成红色醒类化合物，其显色程度与TG的浓度成正比。【试剂】1.甘油三酯液体稳定酶试剂组成(具体含量见相关文献)50mmol/LGOODs 缓冲液(pH7.2)脂蛋白脂酶≥4 000U/L甘油激酶≥40 U/L磷酸甘油氧化酶≥500 U/L过氧化物酶≥2 000U/LATP2.0mmol/L硫酸镁15mmol/L4-AAP0.4mmol/L4-氯酚4.0mmol/L2.三油酸甘油酯标准液2.26mmol/L（200mg/d1）准确称取三油酸甘油酯(平均分子量：885.4)200mg加TritonX-1005ml，用蒸馏水定容至100ml，分装后，4℃保存，切勿冰冻保存。【操作步骤】取3支试管按表9-2操作。GPO 法测定TG 操作步骤表9-2（空白管加入物标准管测定管血清(u)10标准液(μI)-10---蒸馏水(ul)10酶试剂(μl)1 00010001000混匀后37℃水浴5min，用分光光度计比色，以空白管调零，于500nm波长处测各管的吸光度。【计算】同实验48。【参考范围】同实验48
4 【原理】 血清中甘油三酯经脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)作用，可以水解为甘 油和游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)，甘油在 ATP 和甘油激酶(glycerokinase，GK)的作用下， 生成 3-磷酸甘油，再经磷酸甘油氧化酶(glycerophosphate oxidase，GPO)作用氧化生成磷酸二 羟丙酮和过氧化氢(H2O2)，H2O2与 4-氨基安替比林(4-AAP)及 4-氯酚在过氧化物酶(peroxidase， POD)作用下，生成红色醌类化合物，其显色程度与 TG 的浓度成正比。 【试剂】 1. 甘油三酯液体稳定酶试剂组成(具体含量见相关文献) GOODs 缓冲液(pH7.2) 50mmol/L 脂蛋白脂酶 ≥4 000U/L 甘油激酶 ≥40 U/L 磷酸甘油氧化酶 ≥500 U/L 过氧化物酶 ≥2 000U/L ATP 2.0mmol/L 硫酸镁 15mmol/L 4-AAP 0.4mmol/L 4-氯酚 4.0mmol/L 2. 三油酸甘油酯标准液 2.26mmol/L (200mg/d1) 准确称取三油酸甘油酯(平均分子量： 885.4)200mg 加 Triton X-100 5ml，用蒸馏水定容至 100ml，分装后，4℃保存，切勿冰冻保存。 【操作步骤】 取 3 支试管按表 9-2 操作。 表 9-2 GPO 法测定 TG 操作步骤 加入物 空白管 标准管 测定管 血清(μl) － － 10 标准液(μl) － 10 － 蒸馏水(μl) 10 － － 酶试剂(μl) 1 000 1 000 1 000 混匀后 37℃水浴 5 min，用分光光度计比色，以空白管调零，于 500 nm 波长处测各管的 吸光度。 【计算】 同实验 48。 【参考范围】 同实验 48
【注意事项】1．本方法没有进行抽提和吸附，所以血清中游离的甘油对TG测定结果有一定的影响。2.方法中所用酶试剂在4℃避光保存，至少可稳定3天至1周，出现红色时不可再用，试剂空白的吸光度应≤0.05。3．取血前注意事项同实验48，标本4℃存放不宜超过3天，避免TG水解释放出甘油。4.本实验方法的线性上限为11.3mmol/L，若所测TG值超过了11.0mmol/L，则可用生理盐水稀释后再测。【评价】本实验介绍的是一步终点法，具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点，适用于手工和自动化测定；其主要缺点是所测TG值包括了血清中游离的甘油。为了除去FG的干扰，常用的方法有两种：1.外空白法即同时使用不含LPL的酶试剂测定FG作空白值，此法需作双份测定，使成本加倍，但是可同时得到血清中FG数据；2．内空白法又称为两步法或双试剂法，将酶试剂分作两部分，其中LPL和4-AAP组成试剂II，其余部分为试剂1，血清先加试剂1，37℃孵育后，因无LPL存在，TG不被水解，FG在GK和GPO的作用下反应生成H2O2，但因不含4-AAP，不能完成显色反应，故可除去FG的干扰；再加入试剂I，即可测出TG水解生成的甘油。内空白法虽然增加了操作步骤，但不增加试剂成本，且排除FG干扰效果好，预孵育5min即可排除4mmoI/LFG的干扰。本法线性范围在11.4mmol/L以内，精密度为：批内CV≤3%、批间CV≤5%。加入不同浓度TG，平均回收率98.6%，加入甘油的平均回收率103.6%。与乙酰丙酮法比较：y=0.996x一4.2,r=0.9996.因为LPL除水解TG外，亦能水解甘油一酯和甘油二酯(血清中这二者的浓度约占 TG 的3%），所以本法测定结果包含了后二者的值第二节血清胆固醇的测定血清中胆固醇包括CE和FC，在LDL中最多，其次是HDL和VLDL，CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。化学法一般包括：①抽提；②皂化；②毛地黄皂苷沉淀纯化；①显色、比色四个阶段。代表性的方法有Abell-Kendall法。目前临床上常用的是胆固醇氧化酶法
5 【注意事项】 1．本方法没有进行抽提和吸附，所以血清中游离的甘油对 TG 测定结果有一定的影响。 2．方法中所用酶试剂在 4℃避光保存，至少可稳定 3 天至 1 周，出现红色时不可再用， 试剂空白的吸光度应≤0.05。 3．取血前注意事项同实验 48，标本 4℃存放不宜超过 3 天，避免 TG 水解释放出甘油。 4．本实验方法的线性上限为 11.3 mmol/L，若所测 TG 值超过了 11.0mmol/L，则可用生 理盐水稀释后再测。 【评价】 本实验介绍的是一步终点法，具有简便、快速、微量且试剂较稳定等优点， 适用于手工和自动化测定；其主要缺点是所测 TG 值包括了血清中游离的甘油。为了除去 FG 的干扰，常用的方法有两种： 1．外空白法 即同时使用不含 LPL 的酶试剂测定 FG 作空白值，此法需作双份测定，使 成本加倍，但是可同时得到血清中 FG 数据； 2．内空白法 又称为两步法或双试剂法，将酶试剂分作两部分，其中 LPL 和 4-AAP 组 成试剂Ⅱ，其余部分为试剂Ⅰ，血清先加试剂Ⅰ，37℃孵育后，因无 LPL 存在，TG 不被水 解，FG 在 GK 和 GPO 的作用下反应生成 H2O2，但因不含 4-AAP，不能完成显色反应，故可 除去 FG 的干扰；再加入试剂Ⅱ，即可测出 TG 水解生成的甘油。内空白法虽然增加了操作步 骤，但不增加试剂成本，且排除 FG 干扰效果好，预孵育 5 min 即可排除 4 mmol/L FG 的干扰。 本法线性范围在 11.4mmol/L 以内，精密度为：批内 CV≤3%、批间 CV≤5%。加入不同浓度 TG，平均回收率 98.6%，加入甘油的平均回收率 103.6%。与乙酰丙酮法比较：y＝0.996x－ 4.2，r＝0.9996。 因为 LPL 除水解 TG 外，亦能水解甘油一酯和甘油二酯(血清中这二者的浓度约占 TG 的 3%)，所以本法测定结果包含了后二者的值。 第二节 血清胆固醇的测定 血清中胆固醇包括 CE 和 FC，在 LDL 中最多，其次是 HDL 和 VLDL，CM 最少。血清 总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。化学法一般包括：①抽提；②皂化；②毛地黄 皂苷沉淀纯化；④显色、比色四个阶段。代表性的方法有 Abell-Kendall 法。目前临床上常用 的是胆固醇氧化酶法