第三章电泳技术在直流电场中，带电粒子向带相反电荷电极移动的现象称为电泳(electrophoresis）。电泳现象在18世纪被发现，1937年瑞典人Tiseliusy研制了第台自由界面电泳仪，但未能推广，直到1948年Wieland建立了区带电泳后，电泳技术才得以迅速发展。电泳技术可分为自由电泳(无支持物)和区带电泳(有支持物)两大类，其中自由电泳因结构复杂、操作要求高等原因应用并不广泛。而区带电泳可用名种类型的物质做支持体应用较广泛，其中包括滤纸电泳、薄层电泳（薄膜及薄板）、凝胶电泳(琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺)和毛细管高压电泳等。电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外，最主要用于蛋白质、核酸、酶、甚至病毒与细胞的研究。由于某些电泳法设备简单、操作方便和具有较高的分辨率，已成为医学检验中常用的技术。实验9醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋质【原理】血清中各种蛋白质的等电点(pl)大都低于7.0，在pH8.6的缓冲液中，它们都电离成负离子，在电场中向正极移动。因各种蛋白质pI不同，在同一pH下带电荷量有差异，同时各蛋白质的分子大小与分子形状也不相同，因此在同一电场中泳动速度也不同。带电荷多，分子量小者，泳动较快：反之则较慢。醋酸纤维素薄膜(CAM)电泳可将血清蛋白分离为5条区带，从正极端起依次为白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白及-球蛋白。由于染色时染料与蛋白质的结合与蛋白质的量成正比，因此将各蛋白区带剪下，经脱色、比色或经透明处理后直接用光密度计扫描，即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。如同时测定出血清总蛋白浓度，还可计算出各蛋白组分的绝对浓度。【试剂与器材】1.巴比妥缓冲液(pH8.6，离子强度0.06）称取巴比妥钠12.36g、巴比妥2.21g，于500ml蒸馏水中加热溶解，冷却至室温后，用蒸馏水定容至1L
1 第三章 电泳技术 在 直 流 电 场 中 ， 带 电 粒 子 向 带 相 反 电 荷 电 极 移 动 的 现 象 称 为 电 泳 (electrophoresis)。电泳现象在 18 世纪被发现，1937 年瑞典人 Tiseliusy 研制了第一 台自由界面电泳仪，但未能推广，直到 1948 年 Wieland 建立了区带电泳后，电泳技 术才得以迅速发展。电泳技术可分为自由电泳(无支持物)和区带电泳(有支持物)两大 类，其中自由电泳因结构复杂、操作要求高等原因应用并不广泛。而区带电泳可用各 种类型的物质做支持体应用较广泛，其中包括滤纸电泳、薄层电泳(薄膜及薄板)、凝 胶电泳(琼脂、琼脂糖、淀粉胶、聚丙烯酰胺)和毛细管高压电泳等。电泳技术除了用 于小分子物质的分离分析外，最主要用于蛋白质、核酸、酶、甚至病毒与细胞的研 究。由于某些电泳法设备简单、操作方便和具有较高的分辨率，已成为医学检验中常 用的技术。 实验 9 醋酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋质 【原理】 血清中各种蛋白质的等电点(pI)大都低于 7.0，在 pH 8.6 的缓冲液 中，它们都电离成负离子，在电场中向正极移动。因各种蛋白质 pI 不同，在同一 pH 下带电荷量有差异，同时各蛋白质的分子大小与分子形状也不相同，因此在同一电场 中泳动速度也不同。带电荷多，分子量小者，泳动较快；反之则较慢。 醋酸纤维素薄膜(CAM)电泳可将血清蛋白分离为 5 条区带，从正极端起依次为白 蛋白、1 -球蛋白、2 -球蛋白、β-球蛋白及γ-球蛋白。由于染色时染料与蛋白质的 结合与蛋白质的量成正比，因此将各蛋白区带剪下，经脱色、比色或经透明处理后直 接用光密度计扫描，即可计算出血清各蛋白组分的相对百分数。如同时测定出血清总 蛋白浓度，还可计算出各蛋白组分的绝对浓度。 【试剂与器材】 1．巴 比妥缓 冲液 (pH8.6，离 子强度 0.06) 称 取巴 比妥钠 12.36g 、巴比妥 2.21g，于 500ml 蒸馏水中加热溶解，冷却至室温后，用蒸馏水定容至 1L
2.染色液(1）丽春红S染色液：称取丽春红S0.4g、三氯醋酸6g，溶于蒸馏水中并定容至100ml(2)氨基黑10B染色液：①第一种配方(推荐配方)：称取氨基黑10B0.1g，溶于20ml无水乙醇中，加冰醋酸5ml，甘油0.5ml；另取磺柳酸2.5g溶于少量蒸馏水中，加入前液，混和摇匀，再以蒸馏水补足至100ml。②第二种配方：称取氨基黑10B0.5g溶解于50ml甲醇中，加入冰醋酸10ml和蒸馏水40ml，混合即成3.漂洗液(I)3%(V/V)醋酸溶液，适用于丽春红S染色的漂洗。(2）甲醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml，混匀。适用于氨基黑10B染色的漂洗。4.透明液(）液体石蜡或氢萘的润湿透明法，均十分方便。(2）冰醋酸95%乙醇=2.7:7.5的混合液。(3)N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸(3.03mol/LN-甲基-2-吡咯烷酮，0.15mol/L柠檬酸）：称取柠檬酸15g溶于150ml水中，加入N-甲基-2-吡咯烷酮150ml，混匀，加蒸馏水至500ml5.洗脱液(I)0.1mol/LNaOH溶液，适用于丽春红S染色的洗脱。(2)0.4mol/LNaOH溶液，适用于氨基黑10B染色的洗脱6.电泳仪电子管或品体管整流的直流电源，电压0~600V，电流0~300mA。7.电泳槽铂（白金）丝电极的水平电泳槽。8.加样器血红蛋白管和0.2cm×1.5cm有机玻璃片或x线胶片或特制电泳加样器。9.染色皿、漂洗皿、镊子。10．光密度计、721分光光度计。11.醋酸纤维素薄膜规格2cmX×8cm(比色法)，6cm×8cm(扫描法)。2
2 2．染色液 (1) 丽春红 S 染色液：称取丽春红 S 0.4g、三氯醋酸 6g，溶于蒸馏水中并定容至 100ml。 (2) 氨基黑 10B 染色液：①第一种配方(推荐配方)：称取氨基黑 10B 0.1g，溶于 20ml 无水乙醇中，加冰醋酸 5ml，甘油 0.5ml；另取磺柳酸 2.5g 溶于少量蒸馏水 中，加入前液，混和摇匀，再以蒸馏水补足至 100ml。②第二种配方：称取氨基黑 10B 0.5g 溶解于 50ml 甲醇中，加入冰醋酸 10ml 和蒸馏水 40ml，混合即成。 3．漂洗液 (1) 3%(V/V)醋酸溶液，适用于丽春红 S 染色的漂洗。 (2) 甲醇 45ml，冰醋酸 5ml，蒸馏水 50ml，混匀。适用于氨基黑 10B 染色的漂 洗。 4．透明液 (1) 液体石蜡或氢萘的润湿透明法，均十分方便。 (2) 冰醋酸 95%乙醇=2.7:7.5 的混合液。 (3) N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸(3.03mol/L N-甲基-2-吡咯烷酮，0.15mol/L 柠檬 酸)：称取柠檬酸 15g 溶于 150ml 水中，加入 N-甲基-2-吡咯烷酮 150ml，混匀，加 蒸馏水至 500ml。 5．洗脱液 (1) 0.1mol/L NaOH 溶液，适用于丽春红 S 染色的洗脱。 (2) 0.4mol/L NaOH 溶液，适用于氨基黑 10B 染色的洗脱。 6．电泳仪 电子管或晶体管整流的直流电源，电压 0~600V，电流 0~300mA。 7．电泳槽 铂(白金)丝电极的水平电泳槽。 8．加样器 血红蛋白管和 0.2cm×1.5cm 有机玻璃片或 X 线胶片或特制电泳加样 器。 9．染色皿、漂洗皿、镊子。 10．光密度计、721 分光光度计。 11．醋酸纤维素薄膜 规格 2cm×8cm(比色法)，6cm×8cm(扫描法)
【操作步骤】1.准备（1）电泳槽准备：将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲液，使其在同一水平面，液面与支架距离约2~2.5cm，支架宽度调节在5.5~6cm，用三层滤纸或双层纱布搭桥。(2)CAM的准备：选择厚薄一致，透水性能好的CAM，在无光泽面一端1.5cm处用铅笔轻划一横线作点样标记。然后将CAM无光泽面朝下，漂浮于盛有巴比妥缓冲液的平皿中，使之自然浸湿下沉，待充分浸透后(约20min)用镊子取出。2.点样（1）将薄膜条置于洁净滤纸中间，无光泽面朝上，用滤纸轻按吸去CAM上多余的缓冲液。(2)）用血红蛋白吸管取待测新鲜血清3~5u1，均匀涂布于点样用有机玻璃片或x线胶片上，或用加样器蘸少许血清，垂直印在CAM无光滑面划线处，待血清完全渗入薄膜后移开。3.电泳（1）将加样后的薄膜平直架于支架两端，无光泽面朝下，点样侧置于阴极端，用滤纸或纱布将膜的两端与缓冲液连通，平衡5min。(2）将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪的正极和负极联结，打开电源，调电压为8~15V/cm膜长或电流0.3~0.5mA/cm膜宽。夏季通电45min，冬季通电60min。待电泳区带展开约3.5~4.0cm，即可关闭电源。4．染色用镊子取出薄膜条直接投入丽春红S或氨基黑10B染色液中染色5~10min。染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。薄膜条较多时，应避免彼此紧贴致染色不良。5.漂洗准备3~4个漂洗皿，装入漂洗液，从染色液中取出薄膜条并尽量沥去染色液，按顺序投入漂洗液中反复漂洗，直至背景无色为止。6.定量(1)洗脱比色法
3 【操作步骤】 1．准备 (1) 电泳槽准备：将电泳槽置于水平平台上，两侧注入等量的巴比妥缓冲液，使 其在同一水平面，液面与支架距离约 2~2.5cm，支架宽度调节在 5.5~6cm，用三层滤 纸或双层纱布搭桥。 (2) CAM 的准备：选择厚薄一致，透水性能好的 CAM，在无光泽面一端 1.5cm 处用铅笔轻划一横线作点样标记。然后将 CAM 无光泽面朝下，漂浮于盛有巴比妥缓 冲液的平皿中，使之自然浸湿下沉，待充分浸透后(约 20min)用镊子取出。 2．点样 (1) 将薄膜条置于洁净滤纸中间，无光泽面朝上，用滤纸轻按吸去 CAM 上多余 的缓冲液。 (2) 用血红蛋白吸管取待测新鲜血清 3~5μl，均匀涂布于点样用有机玻璃片或 X 线胶片上，或用加样器蘸少许血清，垂直印在 CAM 无光滑面划线处，待血清完全渗 入薄膜后移开。 3．电泳 (1) 将加样后的薄膜平直架于支架两端，无光泽面朝下，点样侧置于阴极端，用 滤纸或纱布将膜的两端与缓冲液连通，平衡 5min。 (2) 将电泳槽的正极和负极分别与电泳仪的正极和负极联结，打开电源，调电压 为 8~15V/cm 膜长或电流 0.3~0.5mA/cm 膜宽。夏季通电 45min，冬季通电 60min。 待电泳区带展开约 3.5~4.0cm，即可关闭电源。 4．染色 用镊子取出薄膜条直接投入丽春红 S 或氨基黑 10B 染色液中染色 5~10min。染色过程中不时轻轻晃动染色皿，使染色充分。薄膜条较多时，应避免彼 此紧贴致染色不良。 5．漂洗 准备 3~4 个漂洗皿，装入漂洗液，从染色液中取出薄膜条并尽量沥去 染色液，按顺序投入漂洗液中反复漂洗，直至背景无色为止。 6．定量 (1) 洗脱比色法
1）氨基黑10B染色法：将各蛋白区带仔细剪下，分别置于各试管内，另从空白背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，在白蛋白管内加入0.4mol/LNaOH溶液6ml(计算时吸光度乘2)，其余各管加入3ml，于37℃水浴20min，并不断摇动，待颜色脱净后，取出冷却。用620nm比色，以空白管调零，读取各管吸光度值。2）丽春红S染色法：用0.1mol/LNaOH溶液脱色，加入量同上，10min后，向白蛋白管中加入40%(v/v)醋酸0.6ml(计算时吸光度乘2)，其余各管加0.3ml，以中和部分NaOH，使色泽加深。用520nm比色，以空白管调零，读取各管吸光度值(2)光密度计扫描法1）透明：不保留的电泳图可用液体石蜡或氢萘浸透后，取出夹在两块优质的薄玻璃间，供扫描用；要保留的电泳图可用冰醋酸乙醇法或N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸法透明。将薄膜放入透明液中2~3min(延长一些时间亦无碍），然后取出，以滚动方式平贴于洁净无划痕的载玻璃片上(勿产生气泡)，将此玻片竖立片刻，除去一定的透明液后，于70~80℃（N-甲基-2-咯烷酮-柠檬酸法透明，90~100℃）烘烤15~20min，取出冷却至室温，即可透明。2）扫描定量：将已透明的薄膜置光密度计的暗箱内，选择波长520nm，描记各蛋白区带峰，并计算各蛋白成分的相对百分含量【计算】各组分蛋白质%=Ax×100Ax表示各个组分蛋白质(Alb、α1、α2、β和-球蛋白)吸光度。At表示各组分蛋白质的吸光度总和。各组分蛋白质绝对浓度(g/L)=血清总蛋白(g/L)×各组分蛋白质百分浓度(%)【参考范围】每个实验室应根据不同的实验条件和检测对象设定参考范围，表3-1、3-2和3-3的参考范围仅供参考
4 1) 氨基黑 10B 染色法：将各蛋白区带仔细剪下，分别置于各试管内，另从空白 背景剪一块平均大小的膜条置于空白管中，在白蛋白管内加入 0.4mol/L NaOH 溶液 6ml(计算时吸光度乘 2)，其余各管加入 3ml，于 37℃水浴 20min，并不断摇动，待 颜色脱净后，取出冷却。用 620nm 比色，以空白管调零，读取各管吸光度值。 2) 丽春红 S 染色法：用 0.1mol/L NaOH 溶液脱色，加入量同上，10min 后，向 白蛋白管中加入 40%(v/v)醋酸 0.6ml(计算时吸光度乘 2 )，其余各管加 0.3ml，以中 和部分 NaOH，使色泽加深。用 520nm 比色，以空白管调零，读取各管吸光度值。 (2) 光密度计扫描法 1) 透明：不保留的电泳图可用液体石蜡或氢萘浸透后，取出夹在两块优质的薄 玻璃间，供扫描用；要保留的电泳图可用冰醋酸乙醇法或 N-甲基-2-吡咯烷酮-柠檬酸 法透明。将薄膜放入透明液中 2~3min(延长一些时间亦无碍)，然后取出，以滚动方 式平贴于洁净无划痕的载玻璃片上(勿产生气泡)，将此玻片竖立片刻，除去一定的透 明 液 后 ， 于 70~80 ℃ （ N- 甲 基 -2- 吡 咯 烷 酮 - 柠 檬 酸 法 透 明 ， 90~100 ℃）烘烤 15~20min，取出冷却至室温，即可透明。 2) 扫描定量：将已透明的薄膜置光密度计的暗箱内，选择波长 520 nm，描记各 蛋白区带峰，并计算各蛋白成分的相对百分含量。 【计算】 100 A A T X 各组分蛋白质％＝ AX 表示各个组分蛋白质(Alb、1、2、β和γ-球蛋白)吸光度。 AT 表示各组分蛋白质的吸光度总和。 各组分蛋白质绝对浓度(g/L)＝血清总蛋白(g/L)×各组分蛋白质百分浓度(%) 【参考范围】 每个实验室应根据不同的实验条件和检测对象设定参考范围，表 3-1、3-2 和 3-3 的参考范围仅供参考
表3-1丽春红S染色直接扫描参考范围蛋白质组分g/L占总蛋白的百分数(%)白蛋白35~5257~68α1-球蛋白1.0~4.01.0~5.7α2一球蛋白4.0~8.04.9~11.2β-球蛋白5.0~10.07.0~13.0丫一球蛋白6.0~13.09.8~18.2表3-2氨基黑10B染色洗脱法参考范围蛋白质组分占总蛋白的百分数(%)白蛋白57.45~71.73α1球蛋白1.76~4.48α2一球蛋白4.04~8.28β一球蛋白6.79~11.39一球蛋白11.18~22.97表3-3氨基黑10B染色直接扫描法参考值蛋白质组分g/L占总蛋白的百分数(%)白蛋白48.8±5.166±6.62.0± 1.0α1-球蛋白1.5 ± 1.1α2一球蛋白3.9±1.45.3±2.0β一球蛋白6.1±2.18.3±1.6丫一球蛋白13.1 ± 5.517.7± 5.8【临床意义】正常血清蛋白电泳一般可分为5条区带，即Alb、αi、α2、β和-球蛋白。脐带血清、胎儿血清、部分原发性肝癌血清，在Alb与αi-球蛋白之间可增加一条甲胎蛋白带。多发性骨髓瘤可分离出6条区带，多出的1条称为M蛋白带。在下列疾病中可见醋纤膜蛋白电泳图明显异常
5 表 3-1 丽春红 S 染色直接扫描参考范围 蛋白质组分 g/L 占总蛋白的百分数(%) 白蛋白 35～52 57～68 1－球蛋白 1.0～4.0 1.0～5.7 2－球蛋白 4.0～8.0 4.9～11.2 β－球蛋白 5.0～10.0 7.0～13.0 γ－球蛋白 6.0～13.0 9.8～18.2 表 3-2 氨基黑 10B 染色洗脱法参考范围 蛋白质组分 占总蛋白的百分数(%) 白蛋白 57.45～71.73 1－球蛋白 1.76～4.48 2－球蛋白 4.04～8.28 β－球蛋白 6.79～11.39 γ－球蛋白 11.18～22.97 表 3-3 氨基黑 10B 染色直接扫描法参考值 蛋白质组分 g/L 占总蛋白的百分数(%) 白蛋白 48.8±5.1 66±6.6 1－球蛋白 1.5±1.1 2.0±1.0 2－球蛋白 3.9±1.4 5.3±2.0 β－球蛋白 6.1±2.1 8.3±1.6 γ－球蛋白 13.1±5.5 17.7±5.8 【临床意义】 正常血清蛋白电泳一般可分为 5 条区带，即 Alb、1、2、β和 γ-球蛋白。脐带血清、胎儿血清、部分原发性肝癌血清，在 Alb 与1-球蛋白之间 可增加一条甲胎蛋白带。多发性骨髓瘤可分离出 6 条区带，多出的 1 条称为 M 蛋白 带。在下列疾病中可见醋纤膜蛋白电泳图明显异常