第五章分子生物学实验技术实验21大鼠肝组织DNA的提取及其含量测定【原理】DNA以核蛋白形式存在于细胞中，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。DNA的提取方法较多，根据实验用途可简可繁。这里介绍一种经济简便不用蛋白酶K提取真核细胞DNA的方法。在DNA抽提缓冲液中，加入SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；加入EDTA可抑制DNase活性，减少DNA降解。分离出来的DNA用酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染，最后用无水乙醇沉淀DNA。260m处DNA有最大吸收峰，利用该原理测DNA的A260，可计算其浓度。【试剂】1.生理盐水。2.TE缓冲液(pH8.0)含10mmol/LTris-HC(pH8.0)，1mmol/LEDTA-Na2(pH8.0)，以103.4Kpa高压蒸汽灭菌，4℃贮存。3.10%SDS固体SDS10g，加双蒸水70ml于42℃水浴溶解，用双蒸水定容至100ml。4.Tris-HCI饱和重蒸酚(pH8.0）将市售的苯酚置于65℃水浴中溶解，用空气冷凝管进行重蒸馏，当温度升高至183℃时开始收集于数个棕色瓶中（每瓶约200ml)，存于一20℃可保存数年。使用前取一瓶重蒸酚于室温放置一段时间后，移至65℃水浴融化（冰箱取出后勿立即放入65℃水浴中，以防玻璃炸裂)。融化后加8-羟基喹啉至终浓度为0.1%(w/v)，溶解混匀此时溶液呈黄色，小心将酚倒入分液漏斗中。加入等体积的1mmol/LTris-HCI(pH8.0)，立即加盖，剧烈振荡并加入固体Tris摇匀(一般加1g固体Tris/100ml酚)。静置分层后从分液漏斗中放出下层黄色酚相，弃上层。将酚重新加至分液漏斗中，加入等体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HCI(pH8.0)，剧烈振荡，直至酚相pH>7.8，将酚装入棕色试剂瓶中，加入0.1倍酚体积的含0.2%β-巯基乙醇的0.1mol/LTris-HC(pH8.0)覆盖酚相，置4℃贮存备用。由于酚重蒸和平衡费时，操作有一定危险，因此也可直接从试剂公司购买Tris-HCI 饱和重蒸酚。5.氯仿/异戊醇(24:1，v:v）均为分析纯。6.10mol/L醋酸铵。7.无水乙醇(AR)。8.10mg/ml RNaseA称取 RNaseA 10mg 溶于10mmol/L Tris-HC(pH7.5)、15mmol/LNaCI
1 第五章 分子生物学实验技术 实验 21 大鼠肝组织 DNA 的提取及其含量测定 【原理】 DNA 以核蛋白形式存在于细胞中，制备 DNA 的原则是既要将 DNA 与蛋白 质、脂类和糖类等分离，又要保持 DNA 分子的完整。DNA 的提取方法较多，根据实验用途 可简可繁。这里介绍一种经济简便不用蛋白酶 K 提取真核细胞 DNA 的方法。在 DNA 抽提缓 冲液中，加入 SDS 可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA 分离；加入 EDTA 可抑制 DNase 活性，减少 DNA 降解。分离出来的 DNA 用酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去 DNA 溶液中微量酚的污染，最后用无水乙醇沉淀 DNA。 260nm 处 DNA 有最大吸收峰，利用该原理测 DNA 的 A260，可计算其浓度。 【试剂】 1．生理盐水。 2．TE 缓冲液(pH8.0) 含 10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA-Na2(pH8.0)，以 103.4Kpa 高压蒸汽灭菌，4℃贮存。 3．10% SDS 固体 SDS 10g，加双蒸水 70ml 于 42℃水浴溶解，用双蒸水定容至 100ml。 4．Tris-HCl 饱和重蒸酚(pH8.0) 将市售的苯酚置于 65℃水浴中溶解，用空气冷凝管进 行重蒸馏，当温度升高至 183℃时开始收集于数个棕色瓶中(每瓶约 200ml)，贮存于－20℃可 保存数年。使用前取一瓶重蒸酚于室温放置一段时间后，移至 65℃水浴融化(冰箱取出后勿立 即放入 65℃水浴中，以防玻璃炸裂)。融化后加 8-羟基喹啉至终浓度为 0.1%(w/v)，溶解混匀， 此时溶液呈黄色，小心将酚倒入分液漏斗中。加入等体积的 1mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，立即 加盖，剧烈振荡并加入固体 Tris 摇匀(一般加 1g 固体 Tris/100ml 酚)。静置分层后从分液漏斗 中放出下层黄色酚相，弃上层。将酚重新加至分液漏斗中，加入等体积的含 0.2%β-巯基乙 醇的 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，剧烈振荡，直至酚相 pH＞7.8，将酚装入棕色试剂瓶中，加入 0.1 倍酚体积的含 0.2%β-巯基乙醇的 0.1mol/L Tris-HCl(pH8.0)覆盖酚相，置 4℃贮存备用。 由于酚重蒸和平衡费时，操作有一定危险，因此也可直接从试剂公司购买 Tris-HCl 饱和 重蒸酚。 5．氯仿/异戊醇(24:1，v:v) 均为分析纯。 6．10 mol/L 醋酸铵。 7．无水乙醇(AR)。 8．10mg/ml RNase A 称取 RNase A 10mg 溶于 10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl
中，于100℃加热煮沸15min灭活DNase，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于一20℃。如为Sigma公司产品，一般则不需加热煮沸【操作步骤】1．迅速处死大鼠，立即取出肝脏约1g，用冷生理盐水洗去附着的血液，滤纸吸干后放入玻璃匀浆器，加入5ml冷TE缓冲液制备匀浆。2.取1ml匀浆液倒入小试管中，加入10%SDS溶液0.1ml，颠倒混匀后，室温10min，溶液变粘稠。3.取饱和酚0.5ml，氯仿：异戊醇(24：1)0.5ml，混合后加入上述溶液中，充分混匀，室温放置10min，其间不断摇动保持溶液呈乳状，3000r/min离心10min。4．小心取出上层水相至小试管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，3000r/min离心5min。5．小心取出上层水相转移到新试管，加入0.3倍水相体积的10mol/L醋酸铵，2.5倍水相体积的无水乙醇充分混匀，纤维状DNA即从溶液中析出。6.用吸管小心取出纤维状DNA，转移到1.5ml离心管，3000r/min，离心5min，小心侄去溶液，用滤纸吸干。7.加1ml蒸馏水和5u1浓度为10mg/ml的RNaseA溶解DNA沉淀，室温放置20min。如DNA难于溶解，可置于56℃水浴20～30min，并不断摇动，直至溶解。8.DNA的含量测定：取0.5mlDNA样品和蒸馏水3.5ml至石英杯中，用蒸馏水调零在752紫外分光光度计上测A260值和A280值。【计算】1.DNA浓度(ug/ml)=A260nm×50×4-0.52.A260mm/A280mm比值【注意事项】1.剧烈振荡可使DNA断裂，因此操作中不能用电动振荡器混匀2．如要得到高纯度DNA，可加入蛋白酶K降解蛋白质。3．根据DNA在260nm处有一吸收峰，而蛋白质在280nm处有一吸收峰的原理，可测定A260m/A280m比值检测DNA的纯度，该比值接近1.8~2.0表示蛋白质污染极少。4．制备重蒸酚和平衡酚过程中应戴手套，防止灼烧皮肤。附：外周血细胞DNA的快速提取2
2 中，于 100℃加热煮沸 15min 灭活 DNase，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于－20℃。如 为 Sigma 公司产品，一般则不需加热煮沸。 【操作步骤】 1．迅速处死大鼠，立即取出肝脏约 1g，用冷生理盐水洗去附着的血液，滤纸吸干后放 入玻璃匀浆器，加入 5ml 冷 TE 缓冲液制备匀浆。 2．取 1ml 匀浆液倒入小试管中，加入 10%SDS 溶液 0.1ml，颠倒混匀后，室温 10min， 溶液变粘稠。 3．取饱和酚 0.5ml，氯仿：异戊醇(24：1)0.5ml，混合后加入上述溶液中，充分混匀，室 温放置 10min，其间不断摇动保持溶液呈乳状，3 000r/min 离心 10min。 4．小心取出上层水相至小试管中，加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，混匀，3 000r/min， 离心 5min。 5．小心取出上层水相转移到新试管，加入 0.3 倍水相体积的 10mol/L 醋酸铵，2.5 倍水 相体积的无水乙醇充分混匀，纤维状 DNA 即从溶液中析出。 6．用吸管小心取出纤维状 DNA，转移到 1.5ml 离心管，3 000r/min，离心 5min，小心倒 去溶液，用滤纸吸干。 7．加 1ml 蒸馏水和 5μl 浓度为 10mg/ml 的 RNase A 溶解 DNA 沉淀，室温放置 20min。 如 DNA 难于溶解，可置于 56℃水浴 20～30min，并不断摇动，直至溶解。 8．DNA 的含量测定：取 0.5ml DNA 样品和蒸馏水 3.5ml 至石英杯中，用蒸馏水调零， 在 752 紫外分光光度计上测 A260 值和 A280值。 【计算】 1．DNA 浓度(μg/ml)＝A260nm×50×4÷0.5 2．A260nm/A280nm比值 【注意事项】 1．剧烈振荡可使 DNA 断裂，因此操作中不能用电动振荡器混匀。 2．如要得到高纯度 DNA，可加入蛋白酶 K 降解蛋白质。 3．根据 DNA 在 260nm 处有一吸收峰，而蛋白质在 280nm 处有一吸收峰的原理，可测 定 A260nm/A280nm比值检测 DNA 的纯度，该比值接近 1.8～2.0 表示蛋白质污染极少。 4．制备重蒸酚和平衡酚过程中应戴手套，防止灼烧皮肤。 附：外周血细胞 DNA 的快速提取
【原理】从全血制备白细胞 DNA可用非离子去污剂NP40 和低盐缓冲液直接破裂血中红细胞和白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，通过离心获得白细胞的细胞核，向核悬液中加入SDS破裂核膜，并使DNA从核蛋白中解离，溶解在一定浓度的NaCI中，经乙醇沉淀即可得到DNA。缓冲液中Mg+的浓度对于获得完整的高分子量DNA十分重要，本实验低盐缓冲液中Mg+浓度是4mmol/L,如超过10mmol/L可导致DNA的降解。缓冲液中的EDTA可抑制DNA的降解【操作步骤】1.取0.5ml外周血置于1.5mlEppendorf(EP)管中，EDTA-Na2抗凝(每管预先加入0.3mo/LEDTA-Naz30ul)，3000r/min离心5min，弃血浆，得沉淀部分。2加0.5m低盐缓冲液(1mml/LTisC7.6m/LCmm/LgC2mm12.5μ1的20%NP40，振荡破碎红细胞，5000r/min离心5min，弃上清。3.用低盐缓冲液洗白细胞2次(每次5000r/min离心5min），弃上清4.加入250ul低盐缓冲液，20ul的10%SDS，混匀，50℃水浴温育10min5.加入100u1饱和NaC(称取4g氯化钠，溶于10ml蒸馏水中即成),剧烈振荡2min,4℃，12000/min离心10min：吸上清于另一干净EP管中，加入1ml预冷的无水乙醇沉淀DNA，12000r/min离心2min，弃上清。7.加1ml预冷的70%乙醇洗涤DNA2次，12000r/min离心2min，弃上清，将EP管倒置于滤纸上，室温干燥。8.加250uITE缓冲液溶解DNA，紫外定量，4℃冰箱保存备用。本实验可在不到 1h内快速提取高质量未降解的全血DNA。实验提取的全血 DNA心存【评价】在室温或37℃温育24h与冻存在一70℃的DNA质量一样，但DNA反复冻融4次以上可导致部分降解本实验可用于提取少至10uI全血样品(可获得340ng左右DNA)或干燥的血液样品，因此本实验适用范围较广。实验22碱裂解法从大肠杆菌中制备质粒DNA从大肠杆菌细胞中分离质粒DNA的方法众多，其分离的依据可根据分子大小不同、碱基组成的差异以及质粒 DNA 的超螺旋共价闭合环状结构的特点进行。目前常用的有碱裂解法(又称碱变性抽提法)、羟基磷灰石柱层析法、质粒DNA释放法、酸酚法、两相法以及溴化乙锭-氯化密度梯度离心法。以上方法各有利弊。但总结多数实验室的实践经验，认为碱裂解法效果良好，经济且收率较高，是一种使用最广泛的制备质粒DNA的方法，也是当今分子生物学研究中的常规方法。制备的质粒DNA可用于酶切、连接、转化以及PCR等【原理】碱裂解分离质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离的目的。当细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与染色体DNA发生变性，3
3 【原理】 从全血制备白细胞 DNA 可用非离子去污剂 NP40 和低盐缓冲液直接破裂血中红细胞和 白细胞的细胞膜，释出血红蛋白及细胞核，通过离心获得白细胞的细胞核，向核悬液中加入 SDS 破裂核膜， 并使 DNA 从核蛋白中解离，溶解在一定浓度的 NaCl 中，经乙醇沉淀即可得到 DNA。 缓冲液中 Mg 2+的浓度对于获得完整的高分子量 DNA 十分重要，本实验低盐缓冲液中 Mg 2+浓度是 4mmol/L，如超过 10mmol/L 可导致 DNA 的降解。缓冲液中的 EDTA 可抑制 DNA 的降解。 【操作步骤】 1．取 0.5ml 外周血置于 1.5ml Eppendorf(EP)管中，EDTA-Na2 抗凝(每管预先加入 0.3mol/L EDTA-Na2 30μl)，3 000r/min 离心 5min，弃血浆，得沉淀部分。 2．加 0.5ml 低盐缓冲液(10mmol/L Tris-HCl，pH7.6，10mmol/L KCl，4mmol/L MgCl2，2mmol/L EDTA)， 12.5μl 的 20% NP40，振荡破碎红细胞，5 000r/min 离心 5min，弃上清。 3．用低盐缓冲液洗白细胞 2 次(每次 5 000r/min 离心 5min)，弃上清。 4．加入 250μl 低盐缓冲液，20μl 的 10%SDS，混匀，50℃水浴温育 10min。 5．加入 100μl 饱和 NaCl(称取 4g 氯化钠，溶于 10ml 蒸馏水中即成)，剧烈振荡 2min，4℃，12 000r/min 离心 10min。 6． 吸上清于另一干净 EP 管中，加入 1ml 预冷的无水乙醇沉淀 DNA，12 000r/min 离心 2min，弃 上清。 7．加 1ml 预冷的 70%乙醇洗涤 DNA 2 次，12 000r/min 离心 2min，弃上清，将 EP 管倒置于滤纸上， 室温干燥。 8．加 250μl TE 缓冲液溶解 DNA，紫外定量，4℃冰箱保存备用。 【评价】 本实验可在不到 1h 内快速提取高质量未降解的全血 DNA。实验提取的全血 DNA 贮存 在室温或 37℃温育 24h 与冻存在－70℃的 DNA 质量一样，但 DNA 反复冻融 4 次以上可导致部分降解。 本实验可用于提取少至 10μl 全血样品(可获得 340ng 左右 DNA)或干燥的血液样品，因此本实验适用范围 较广。 实验 22 碱裂解法从大肠杆菌中制备质粒 DNA 从大肠杆菌细胞中分离质粒 DNA 的方法众多，其分离的依据可根据分子大小不同、碱 基组成的差异以及质粒 DNA 的超螺旋共价闭合环状结构的特点进行。目前常用的有碱裂解 法(又称碱变性抽提法)、羟基磷灰石柱层析法、质粒 DNA 释放法、酸酚法、两相法以及溴化 乙锭-氯化铯密度梯度离心法。以上方法各有利弊。但总结多数实验室的实践经验，认为碱裂 解法效果良好，经济且收率较高，是一种使用最广泛的制备质粒 DNA 的方法，也是当今分 子生物学研究中的常规方法。制备的质粒 DNA 可用于酶切、连接、转化以及 PCR 等。 【原理】 碱裂解分离质粒 DNA 是基于染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性与复性的差异 而达到分离的目的。当细胞在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与染色体 DNA 发生变性
加入醋酸钾中和液，进行离心后，它们随细胞碎片沉淀下来，而变性的质粒DNA又恢复到原来的构型留在上清中，再经酚/氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒DNA质粒DNA的存在形式有3种：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②开环DNA，此种质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂；③线性DNA，因质粒DNA的两条链在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒DNA的3种形式泳动速度：超螺旋>线性>开环。【试剂】1.菌种含pBR322或其他质粒DNA的大肠杆菌工程菌如HB101，DH5α，JM109等如实验后需直接酶切制备的质粒DNA，可选用科研工作中用EcoRI非定向克隆构建的重组质粒DNA转化的大肠杆菌。2.LB液体培养基称取胰蛋白陈3.0g，酵母提取物1.5g，NaCI3.0g，加双蒸水200m溶解，用5mol/LNaOH调至pH7.4，定容至300ml，转移至三角烧瓶中，以103.4Kpa高压灭菌20min。3.10mg/ml氨苄青霉素(Amp)溶液在无菌条件下配制，一20℃贮存备用。4.含Amp的LB固体培养基每100mlLB培养液在临高压灭菌前加入1.5g琼脂，以103.4KPa高压灭菌20min，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。应使培养基降温至50℃用手背碰一下瓶壁不致烫手），方可加入Amp，按每100ml培养基加10mg/mlAmp溶液1ml，使其终浓度为100μg/ml，然后在超净台上铺平板，90mm直径的培养血约需25ml培养基。5.Tris-HCI 饱和酚(pH8.0)与TE缓冲液同实验21。6.溶液I含50mmol/L葡萄糖，10mmol/EDTA-Na2，25mmol/LTris-HCI(pH8.0)，临用前加溶菌酶至2mg/ml。7. 溶液II含200mmol/LNaOH，10g/LSDS，临用前用两种溶液的贮存液配制8.溶液IⅢl5mol/L醋酸钾溶液60ml(称取29.4g醋酸钾定容至60ml)，冰醋酸11.5ml和双蒸水28.5ml混合而成。9.10mg/mlRNaseA同实验21。10.50×TAE电泳缓冲液取Tris24.2g，冰醋酸5.7ml，0.25mo/LEDTA(pH8.0)20ml加蒸馏水至100ml。1XTAE为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。11.溴酚蓝指示剂溶液(6×上样缓冲液）称取溴酚蓝100mg，加双蒸水5ml，在室温下过夜，待溶解后再称取蔗糖25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至50ml，加入NaOH1滴，调至蓝色。4
4 加入醋酸钾中和液，进行离心后，它们随细胞碎片沉淀下来，而变性的质粒 DNA 又恢复到 原来的构型留在上清中，再经酚/氯仿抽提乙醇沉淀等步骤获得质粒 DNA。 质粒 DNA 的存在形式有 3 种：①共价闭环 DNA，常以超螺旋形式存在；②开环 DNA， 此种质粒 DNA 两条链中有一条发生一处或多处断裂；③线性 DNA，因质粒 DNA 的两条链 在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒 DNA 的 3 种形式泳动速度：超螺旋＞线性＞开环。 【试剂】 1．菌种 含 pBR322 或其他质粒 DNA 的大肠杆菌工程菌如 HB101，DH5α，JM109 等， 如实验后需直接酶切制备的质粒 DNA，可选用科研工作中用 EcoRⅠ非定向克隆构建的重组 质粒 DNA 转化的大肠杆菌。 2．LB 液体培养基 称取胰蛋白胨 3.0g，酵母提取物 1.5g，NaCl 3.0g，加双蒸水 200ml 溶解，用 5mol/L NaOH 调至 pH7.4，定容至 300ml，转移至三角烧瓶中，以 103.4Kpa 高压灭 菌 20min。 3．10mg/ml 氨苄青霉素(Amp)溶液 在无菌条件下配制，－20℃贮存备用。 4．含 Amp 的 LB 固体培养基 每 100ml LB 培养液在临高压灭菌前加入 1.5g 琼脂，以 103.4KPa 高压灭菌 20min，溶液尚未完全冷却时，即应取出培养基，并轻轻摇动以使琼脂均 匀分布于整个培养基中。必须小心，此时培养基溶液可能过热，旋动液体会发生暴沸。应使 培养基降温至 50℃(用手背碰一下瓶壁不致烫手)，方可加入 Amp，按每 100ml 培养基加 10mg/ml Amp 溶液 1ml，使其终浓度为 100μg/ml，然后在超净台上铺平板，90mm 直径的培 养皿约需 25ml 培养基。 5．Tris-HCl 饱和酚(pH8.0)与 TE 缓冲液 同实验 21。 6．溶液Ⅰ 含 50mmol/L 葡萄糖，10mmol/ EDTA-Na2，25mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，临用 前加溶菌酶至 2mg/ml。 7．溶液Ⅱ 含 200mmol/L NaOH，10g/L SDS，临用前用两种溶液的贮存液配制。 8．溶液Ⅲ 5mol/L 醋酸钾溶液 60ml(称取 29.4g 醋酸钾定容至 60ml)，冰醋酸 11.5ml 和 双蒸水 28.5ml 混合而成。 9．10mg/ml RNase A 同实验 21。 10．50×TAE 电泳缓冲液 取 Tris24.2g，冰醋酸 5.7ml，0.25mol/L EDTA(pH8.0)20ml， 加蒸馏水至 100ml。1×TAE 为配制琼脂糖凝胶及其电泳的应用缓冲液。 11．溴酚蓝指示剂溶液(6×上样缓冲液) 称取溴酚蓝 100mg，加双蒸水 5ml，在室温下过 夜，待溶解后再称取蔗糖 25g，加双蒸水溶解后移入溴酚蓝溶液中，摇匀后定容至 50ml，加 入 NaOH 1 滴，调至蓝色
12.1mg/ml溴化乙锭(EB）戴手套谨慎称取EB20mg于棕色试剂瓶中，加20ml双蒸水，溶解后贮于4℃备用，配制琼脂糖凝胶时每100ml凝胶加50ulEB。13.DNA分子量标准根据需要购买，一般浓度为0.5ug/ul。13．其他试剂氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、异戊醇。【操作步骤】1．用接种环挑取1环冷冻保存的含质粒DNA大肠杆菌工程菌，划线接种于含有Amp的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养约12h(过夜)。2.用接种针或消毒牙签挑取单菌落于盛有2ml LB液体培养基(含100uμg/mlAmp)的试管中，37℃摇荡培养过夜。3．将菌液收集在1.5ml的EP管中，10000r/min离心2min，弃上清，将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体流出。4.在沉淀中加入溶液1100ul，涡旋混匀，静置5min。5.加入新鲜配制的溶液II200u1，颠倒数次，轻轻混匀，冰浴5~10min(溶液变透明，粘稠)。6．加入溶液IⅢI150μ1，颠倒混匀，冰浴5～10min(溶液出现白色沉淀)。7.12000r/min离心2min，将上清转移至另一EP管中。8.加等体积酚抽提1次，12000r/min离心2min，取上层水相转移至另一EP管。9.加等体积氯仿/异戊醇(24：1，v/v)抽提1次，12000r/min离心2min，取上层水相转移至另一EP管。10.加入2倍体积无水乙醇振荡混匀，于室温放置2min沉淀DNA。12000r/min，离心5min，弃乙醇。11.用70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min，离心5min，弃乙醇，室温下静置使乙醇挥发或真空干燥。12.用50u1含RNaseA的TE缓冲液溶解DNA沉淀，振荡，室温放置20min13.制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量，见表5-1。表 5-1 琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA 大小范围的关系凝胶中的琼脂糖含量[%(w/v)]线性 DNA 分子的有效分离范围(kb)0.35~600.61~200.7 0.8~105
5 12．1 mg/ml 溴化乙锭(EB) 戴手套谨慎称取 EB 20mg 于棕色试剂瓶中，加 20ml 双蒸 水，溶解后贮于 4℃备用，配制琼脂糖凝胶时每 100ml 凝胶加 50μl EB。 13．DNA 分子量标准 根据需要购买，一般浓度为 0.5μg/μl。 13．其他试剂 氯仿、异丙醇、无水乙醇、琼脂糖、异戊醇。 【操作步骤】 1．用接种环挑取 1 环冷冻保存的含质粒 DNA 大肠杆菌工程菌，划线接种于含有 Amp 的 LB 固体培养基平板上，37℃倒置培养约 12h(过夜)。 2．用接种针或消毒牙签挑取单菌落于盛有 2 ml LB 液体培养基(含 100μg/ml Amp)的试管 中，37℃摇荡培养过夜。 3．将菌液收集在 1.5ml 的 EP 管中，10 000r/min 离心 2min，弃上清，将离心管倒置于一 纸巾上，以使所有液体流出。 4．在沉淀中加入溶液Ⅰ 100μl，涡旋混匀，静置 5min。 5．加入新鲜配制的溶液Ⅱ 200μl，颠倒数次，轻轻混匀，冰浴 5～10min(溶液变透明， 粘稠)。 6．加入溶液Ⅲ150μl，颠倒混匀，冰浴 5～10min(溶液出现白色沉淀)。 7．12 000r/min 离心 2min，将上清转移至另一 EP 管中。 8．加等体积酚抽提 1 次，12 000r/min 离心 2min，取上层水相转移至另一 EP 管。 9．加等体积氯仿/异戊醇(24：1，v/v)抽提 1 次，12 000r/min 离心 2min，取上层水相转移 至另一 EP 管。 10．加入 2 倍体积无水乙醇振荡混匀，于室温放置 2min 沉淀 DNA。12 000r/min，离心 5min，弃乙醇。 11．用 70%乙醇洗涤沉淀，12 000r/min，离心 5min，弃乙醇，室温下静置使乙醇挥发或 真空干燥。 12．用 50μl 含 RNase A 的 TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀，振荡，室温放置 20min。 13．制备琼脂糖凝胶 按照被分离 DNA 的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量，见表 5-1。 表 5-1 琼脂糖凝胶浓度与分辨 DNA 大小范围的关系 凝胶中的琼脂糖含量[%(w/v)] 线性 DNA 分子的有效分离范围(kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10