第七章血清(浆)蛋白质测定实验34双缩脲法测定血清总蛋白【原理】血清(浆)中蛋白质的肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与 2 价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲(H2N-OC-NH-CO-NH2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。【试剂与器材】可购商品试剂或自配。1.6mol/LNaOH溶液称取NaOH240g，溶于新鲜制备的蒸馏水(或刚煮沸冷却的去离子水)约800ml中，冷却后定容至1L，贮于有盖塑料瓶中。若用非新开瓶的NaOH，须先配成饱和溶液，静置2周左右，使碳酸盐沉淀，其上清饱和NaOH溶液经滴定后，算出准确浓度再使用。2.双缩脲试剂称取硫酸铜结晶（CuSO45H2O)3g溶于新鲜制备的蒸馏水（或刚煮沸冷却的去离子水)500ml中，加入酒石酸钾钠(NaKC4H4O·4H2O，用以结合Cu2+，防止 CuO在碱性条件下沉淀)9g 和KI(防止碱性酒石酸铜自动还原并防止Cu20的离析)5g，待完全溶解后，在搅拌下加入6mol/LNaOH溶液100ml，并用蒸馏水定容至1L，置塑料瓶中盖紧保存。此试剂室温下可稳定半年，若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。3.双缩脲空白试剂除不含硫酸铜外，其余成分与双缩脲试剂相同。4.60~70g/L蛋白质标准液常用牛血清白蛋白或收集混合血清(无黄疽、无溶血、乙型肝炎表面抗原阴性、肝肾功能正常的人血清)，经凯氏定氮法定值，亦可用定值参考血清或标准白蛋白作标准。但定值质控血清定值准确性较差，不能
1 第七章 血清(浆)蛋白质测定 实验 34 双缩脲法测定血清总蛋白 【原理】 血清(浆)中蛋白质的肽键(-CO-NH-)在碱性溶液中能与 2 价铜离子 作用生成稳定的紫红色络合物。此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲 (H2N-OC-NH-CO-NH2)在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称 之为双缩脲反应。这种紫红色络合物在 540nm 处有明显吸收峰，吸光度在一定范 围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得 蛋白质含量。 【试剂与器材】 可购商品试剂或自配。 1．6 mol/L NaOH 溶液 称取 NaOH 240g，溶于新鲜制备的蒸馏水(或刚煮沸 冷却的去离子水)约 800ml 中，冷却后定容至 1 L，贮于有盖塑料瓶中。若用非新 开瓶的 NaOH，须先配成饱和溶液，静置 2 周左右，使碳酸盐沉淀，其上清饱和 NaOH 溶液经滴定后，算出准确浓度再使用。 2．双缩脲试剂 称取硫酸铜结晶(CuSO4·5H2O) 3g 溶于新鲜制备的蒸馏水(或 刚煮沸冷却的去离子水)500ml 中，加入酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O，用以结合 Cu2+，防止 CuO 在碱性条件下沉淀)9g 和 KI(防止碱性酒石酸铜自动还原并防止 Cu2O 的离析)5g，待完全溶解后，在搅拌下加入 6mol/L NaOH 溶液 100ml，并用 蒸馏水定容至 1L，置塑料瓶中盖紧保存。此试剂室温下可稳定半年，若贮存瓶中 有黑色沉淀出现，则需要重新配制。 3．双缩脲空白试剂 除不含硫酸铜外，其余成分与双缩脲试剂相同。 4．60～70g/L 蛋白质标准液 常用牛血清白蛋白或收集混合血清(无黄疸、无 溶血、乙型肝炎表面抗原阴性、肝肾功能正常的人血清)，经凯氏定氮法定值，亦 可用定值参考血清或标准白蛋白作标准。但定值质控血清定值准确性较差，不能
用作血清总蛋白测定的标准物。5.仪器自动生化分析仪或分光光度计。【操作步骤】1.生化自动分析仪法按试剂盒说明书提供的参数进行操作。2.手工操作法（1）手工操作参数：波长540nm，光径1cm；温度：室温（18~26℃）；模式终点法；反应时间：30min，样本量：100ul，试剂量：5ml。(2)操作：取试管4支，标明测定管(U)、标准管(S)、标本空白管(B)、试剂空白管(RB)，按表7-1 操作。表7-1双缩脲法测定血清总蛋白操作步骤加入物(ml)BRBsU血清0.10-一0.10--蛋白标准液0.10-蒸馏水0.10-双缩脲空白试剂5.0--5.0 5.05.0双缩脲试剂/混匀，置25℃30min或37℃10min，在波长540nm处比色，用蒸馏水调零，测各管吸光度。【计算】4.-4e-4×蛋白标准液浓度(g/L)血清总蛋白(g / L)A,-ARB-AB【参考范围】正常成人参考范围为60～80g/L。长久卧床者约低3～5g/L，60岁以上约低2g/L，新生儿总蛋白浓度较低，随后逐月缓慢上升，大约1年后达成人水平。参见表7-2。2
2 用作血清总蛋白测定的标准物。 5．仪器 自动生化分析仪或分光光度计。 【操作步骤】 1．生化自动分析仪法 按试剂盒说明书提供的参数进行操作。 2．手工操作法 (1) 手工操作参数：波长 540nm，光径 1cm；温度：室温(18~26℃)；模式： 终点法；反应时间：30min，样本量：100μl，试剂量：5ml。 (2) 操作：取试管 4 支，标明测定管(U)、标准管(S)、标本空白管(B)、试剂空 白管(RB)，按表 7-1 操作。 表 7-1 双缩脲法测定血清总蛋白操作步骤 加入物(ml) B RB S U 血清 0.10 － － 0.10 蛋白标准液 － － 0.10 － 蒸馏水 － 0.10 － － 双缩脲空白试剂 5.0 － － － 双缩脲试剂 － 5.0 5.0 5.0 混匀，置 25℃30min 或 37℃10min，在波长 540nm 处比色，用蒸馏水调零， 测各管吸光度。 【计算】 ( / ) (g / L) A A A A A A g L s RB B 血清总蛋白 u RB B 蛋白标准液浓度 − − − − 【参考范围】 正常成人参考范围为 60～80g/L。长久卧床者约低 3～5g/L， 60 岁以上约低 2g/L，新生儿总蛋白浓度较低，随后逐月缓慢上升，大约 1 年后达 成人水平。参见表 7-2
表7-2血清TP与年龄和体位的关系早产儿>3岁60~80g/L36~60 g/L新生儿成人46~70g/L非卧床1周龄44~76g/L64~83g/L卧床60~78g/L7月龄～1岁51~73g/L1~2 岁56~75 g/L【临床意义】1.血清总蛋白浓度降低(1）蛋白质合成障碍：当肝功能严重受损时，蛋白质合成减少，以白蛋白降低最为显著。(2）蛋白质丢失增加：严重烧伤，大量血浆渗出；大出血；肾病综合征尿中长期丢失蛋白质；溃疡性结肠炎可从粪便中长期丢失一定量的蛋白质。(3）营养不良或消耗增加：营养失调、低蛋白饮食、维生素缺乏症或慢性肠道疾病所引起的吸收不良使体内缺乏合成蛋白质的原料；长期患消耗性疾病，如严重结核病、恶性肿瘤和甲状腺功能亢进等，均可导致血清总蛋白浓度降低。(4）血浆稀释：如静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留2.血清总蛋白浓度增高（1）蛋白质合成增加：大多见于多发性骨髓瘤患者，此时主要是异常球蛋白增加，使血清总蛋白增加。(2）血浆浓缩：如急性脱水(如呕吐、腹泻、高烧等)，外伤性休克(毛细血管通透性增大)，慢性肾上腺皮质功能减退(尿排钠增多引起继发性失水)。【注意事项】1.黄疽血清、严重溶血；葡萄糖、酚酞及溴磺酰钠对本法有明显干扰，故用标本空白管来消除。但如标本空白管吸光度太高，可影响测定的准确度
3 表 7-2 血清 TP 与年龄和体位的关系 早产儿 36～60 g/L ≥3 岁 60～80g/L 新生儿 46～70g/L 成人 1 周龄 44～76g/L 非卧床 64～83g/L 7 月龄～1 岁 51～73g/L 卧床 60～78g/L 1～2 岁 56～75 g/L 【临床意义】 1．血清总蛋白浓度降低 (1) 蛋白质合成障碍：当肝功能严重受损时，蛋白质合成减少，以白蛋白降低 最为显著。 (2) 蛋白质丢失增加：严重烧伤，大量血浆渗出；大出血；肾病综合征尿中长 期丢失蛋白质；溃疡性结肠炎可从粪便中长期丢失一定量的蛋白质。 (3) 营养不良或消耗增加：营养失调、低蛋白饮食、维生素缺乏症或慢性肠道 疾病所引起的吸收不良使体内缺乏合成蛋白质的原料；长期患消耗性疾病，如严 重结核病、恶性肿瘤和甲状腺功能亢进等，均可导致血清总蛋白浓度降低。 (4) 血浆稀释：如静脉注射过多低渗溶液或各种原因引起的水钠潴留。 2．血清总蛋白浓度增高 (1) 蛋白质合成增加：大多见于多发性骨髓瘤患者，此时主要是异常球蛋白增 加，使血清总蛋白增加。 (2) 血浆浓缩：如急性脱水(如呕吐、腹泻、高烧等)，外伤性休克(毛细血管通 透性增大)，慢性肾上腺皮质功能减退(尿排钠增多引起继发性失水)。 【注意事项】 1．黄疸血清、严重溶血；葡萄糖、酚酞及溴磺酞钠对本法有明显干扰，故用 标本空白管来消除。但如标本空白管吸光度太高，可影响测定的准确度
2.高脂血症混浊血清会干扰比色，可采用下述方法消除：取2支带塞试管或离心管，各加待测血清0.1ml，再加蒸馏水0.5ml和丙酮10ml，塞紧并颠倒混匀10次后离心，倾去上清液，将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述相同的其他操作和计算。3.本法也可用于血清总蛋白浓度的标化，测定的操作步骤完全与测定标本时相同，但显色温度须控制在(25土1)℃的范围内，以及使用经过校正的高级分光光度计(波长带宽≤2nm，比色杯光径为准确1.0cm)进行比色。然后再按下式计算标化结果：血清总蛋白(g/L)4-Am-4,510.10.298式中0.298为蛋白质双缩脲络合物的比吸光系数。即按Doumas双缩脲试剂的标准配方，在上述规定的测定条件下，双缩脲反应液中蛋白质浓度为1.0g/L时的吸光度。【评价】1.双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系，与蛋白质的种类、分子量及氨基酸的组成无明显关系，各种蛋白质的显色程度基本相同。2.本法重复性好，RCV为4%，CCV为3.9%；线性范围为0~140g/L；本法干扰少，并且大多可以避免；使用单一的稳定试剂，操作简便、快速，既适于手工操作，也便于自动化分析，已被推荐为测定血清总蛋白的参考方法。3.唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍。但本法的检出限为0.2~1.7g/L，这相当于70g/L的血清3～24u1，已能满足临床生化检验的需要。4．本法是临床测定血清总蛋白质首选最方便、最实用的常规方法。5．临床上常见的血清蛋白定量法主要有双缩脲法、临床折射计法、染料结合法、BCA法和免疫比浊法
4 2．高脂血症混浊血清会干扰比色，可采用下述方法消除：取 2 支带塞试管或 离心管，各加待测血清 0.1ml，再加蒸馏水 0.5ml 和丙酮 10ml，塞紧并颠倒混匀 10 次后离心，倾去上清液，将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。向沉淀中分别加 入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述相同的其他操作和计算。 3．本法也可用于血清总蛋白浓度的标化，测定的操作步骤完全与测定标本时 相同，但显色温度须控制在(25±1)℃的范围内，以及使用经过校正的高级分光光 度计(波长带宽≤2nm，比色杯光径为准确 1.0cm)进行比色。然后再按下式计算标 化结果： 0.1 5.1 0.298 ( / ) Au − ARB − AB 血清总蛋白 g L 式中 0.298 为蛋白质双缩脲络合物的比吸光系数。即按 Doumas 双缩脲试剂的 标准配方，在上述规定的测定条件下，双缩脲反应液中蛋白质浓度为 1.0g/L 时的 吸光度。 【评价】 1．双缩脲显色反应仅和蛋白质中肽键数成正比关系，与蛋白质的种类、分子 量及氨基酸的组成无明显关系，各种蛋白质的显色程度基本相同。 2．本法重复性好，RCV 为 4%，CCV 为 3.9%；线性范围为 0～140g/L；本法 干扰少，并且大多可以避免；使用单一的稳定试剂，操作简便、快速，既适于手 工操作，也便于自动化分析，已被推荐为测定血清总蛋白的参考方法。 3．唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约 100 倍。但本法的检出限为 0.2～ 1.7g/L，这相当于 70g/L 的血清 3～24μl，已能满足临床生化检验的需要。 4．本法是临床测定血清总蛋白质首选最方便、最实用的常规方法。 5．临床上常见的血清蛋白定量法主要有双缩脲法、临床折射计法、染料结合 法、BCA 法和免疫比浊法
实验35溴甲酚绿法测定血清白蛋白【原理】血清白蛋白在pH4.2的缓冲液中带正电荷，在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿(bromocresolgreen，BCG)结合形成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰，其颜色深浅与白蛋白浓度成正比例，与同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白含量。【试剂与器材】可购商品试剂或自配。1.0.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液(pH4.0）称取NaOH10g和琥珀酸56g，溶于蒸馏水800ml中，用1mol/LNaOH溶液调至pH4.1土0.05后，加蒸馏水定容至1L。置4℃冰箱保存。2.10mmol/LBCG贮存液称取BCG(MW=720.02)1.80g溶于1mol/LNaOH溶液5ml中，加蒸馏水至250ml。3.叠氮钠贮存液称取叠氮钠4.0g溶于蒸馏水中，配成100ml。4.聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)贮存液称取Briji-3525g溶于蒸馏水约80ml中，加温助溶，冷却后加蒸馏水至100ml。室温可稳定一年。5.BCG试剂在1L容量瓶内加蒸馏水约400ml，琥珀酸缓冲贮存液100ml用吸管准确加入BCG贮存液8.0ml，并用蒸馏水冲洗吸管壁上残留的染料，加叠氮钠贮存液2.5ml、Brij-35贮存液2.5ml，最后加蒸馏水至刻度，混匀。此溶液pH应为4.15土0.05，盛于加塞的聚乙烯瓶内。在室温保存可稳定半年。6.60g/L白蛋白标准液称取人血清白蛋白6g、叠氮钠50mg，溶于蒸馏水中并缓慢搅拌助溶，配成100ml。密封贮存于4℃冰箱，可稳定半年。也可用定值参考血清白蛋白标准。7．仪器自动生化分析仪或分光光度计。【操作步骤】1．生化自动分析仪分析法各参数见有关仪器操作说明书
5 实验 35 溴甲酚绿法测定血清白蛋白 【原理】 血清白蛋白在 pH4.2 的缓冲液中带正电荷，在有非离子型表面活 性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿(bromocresol green，BCG)结合形成蓝 绿色复合物，在波长 630nm 处有吸收峰，其颜色深浅与白蛋白浓度成正比例，与 同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白含量。 【试剂与器材】 可购商品试剂或自配。 1．0.5mol/L 琥珀酸缓冲贮存液(pH4.0) 称取 NaOH 10g 和琥珀酸 56g，溶于 蒸馏水 800ml 中，用 1mol/L NaOH 溶液调至 pH4.1±0.05 后，加蒸馏水定容至 1L。 置 4℃冰箱保存。 2．10mmol/L BCG 贮存液 称取 BCG(MW＝720.02)1.80g 溶于 1mol/L NaOH 溶液 5ml 中，加蒸馏水至 250ml。 3．叠氮钠贮存液 称取叠氮钠 4.0g 溶于蒸馏水中，配成 100ml。 4．聚氧化乙烯月桂醚(Brij-35)贮存液 称取 Brij-35 25g 溶于蒸馏水约 80ml中， 加温助溶，冷却后加蒸馏水至 100ml。室温可稳定一年。 5．BCG 试剂 在 1L 容量瓶内加蒸馏水约 400ml，琥珀酸缓冲贮存液 100ml， 用吸管准确加入 BCG 贮存液 8.0ml，并用蒸馏水冲洗吸管壁上残留的染料，加叠 氮钠贮存液 2.5ml、Brij-35 贮存液 2.5ml，最后加蒸馏水至刻度，混匀。此溶液 pH 应为 4.15±0.05，盛于加塞的聚乙烯瓶内。在室温保存可稳定半年。 6．60g/L 白蛋白标准液 称取人血清白蛋白 6g、叠氮钠 50mg，溶于蒸馏水中 并缓慢搅拌助溶，配成 100ml。密封贮存于 4℃冰箱，可稳定半年。也可用定值参 考血清白蛋白标准。 7．仪器 自动生化分析仪或分光光度计。 【操作步骤】 1．生化自动分析仪分析法 各参数见有关仪器操作说明书