第六章方法学评价与试剂盒评价实验临床生化方法学评价与试剂盒质量评价是通过实验的途径客观评价实验方法及其试剂分析性能的重要手段。通过评价实验的教学，在让学生正确掌握方法学评价和试剂盒评价实验的设计原理和基本方法，增强方法优选意识，为正确选择、评价和改进临床生化方法及其试剂盒，培养学生具有初步科研的能力，开拓创新等方面打好坚实的基础具有重要意义。本章选用血糖测定项目，评价方法为葡萄糖氧化酶法(GOD-POD法)及其试剂盒，比较方法采用血糖测定的参考方法已糖激酶法(HK 法)。目前，两法均有试剂盒供应临床使用。第一节 方法学评价试验GOD-POD 法和 HK 法在方法学上的最大差异在于两者测血糖的特异性不同。GOD-POD法第一步反应相当特异，GOD仅作用于β-D葡萄糖，此时如果用氧电极来测定氧的消耗速率，此法第一步反应即完成，特异性很高，但目前为临床方便常将过氧化物酶(POD)与之相偶联，测定GOD氧化葡萄糖生成的H2O2，此法存在两个问题：①由于POD特异性较差，可作用于血中其它过氧化物，使结果偏高；②H2O2是强氧化剂，标本中共存的维生素C、尿酸等能使其还原，干扰测定结果，尤其在临床用药和高尿酸血症时特别敏感。HK法的第一步反应由于HK特异性较低，不仅作用于葡萄糖，也作用于其它单糖生成相应的6-磷酸衍生物但与它相偶联的指示酶葡萄糖6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)是特异性很高的酶，和其它单糖-6-磷酸无作用，仅选择性地作用葡萄糖6-磷酸(G-6-P)，结果十分准确。由此可见，HK法优于GOD-POD法，HK法被国际公认为参考方法，GOD-POD法只能用作临床常规检测方法，评价方法和比较方法以及相应的试剂盒组成见本章后附录。实验27线性范围试验在光谱分析中，测定该实验条件下被测物质符合Beer定律的浓度范围(线性范围)，是评价分析方法准确性和实用性的重要工作。通过线性范围测定，选择线性段作为该方法的分析范围，直线上任何一点的待测物浓度与吸光度的比值均为一常数，其斜率tan都相等，即一tano此处的值K称为校正常数，可用于计算测定结果。这样，可使具有临床意义的标本测定
1 第六章 方法学评价与试剂盒评价实验 临床生化方法学评价与试剂盒质量评价是通过实验的途径客观评价实验方法及其试剂分 析性能的重要手段。通过评价实验的教学，在让学生正确掌握方法学评价和试剂盒评价实验 的设计原理和基本方法，增强方法优选意识，为正确选择、评价和改进临床生化方法及其试 剂盒，培养学生具有初步科研的能力，开拓创新等方面打好坚实的基础具有重要意义。 本章选用血糖测定项目，评价方法为葡萄糖氧化酶法(GOD-POD 法)及其试剂盒，比较方 法采用血糖测定的参考方法已糖激酶法(HK 法)。目前，两法均有试剂盒供应临床使用。 第一节 方法学评价试验 GOD-POD 法和 HK 法在方法学上的最大差异在于两者测血糖的特异性不同。GOD-POD 法第一步反应相当特异，GOD 仅作用于β-D 葡萄糖，此时如果用氧电极来测定氧的消耗速 率，此法第一步反应即完成，特异性很高，但目前为临床方便常将过氧化物酶(POD)与之相 偶联，测定 GOD 氧化葡萄糖生成的 H2O2，此法存在两个问题：①由于 POD 特异性较差，可 作用于血中其它过氧化物，使结果偏高；②H2O2 是强氧化剂，标本中共存的维生素 C、尿酸 等能使其还原，干扰测定结果，尤其在临床用药和高尿酸血症时特别敏感。HK 法的第一步 反应由于 HK 特异性较低，不仅作用于葡萄糖，也作用于其它单糖生成相应的 6-磷酸衍生物， 但与它相偶联的指示酶葡萄糖 6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)是特异性很高的酶，和其它单糖-6-磷 酸无作用，仅选择性地作用葡萄糖 6-磷酸(G-6-P)，结果十分准确。 由此可见，HK 法优于 GOD-POD 法，HK 法被国际公认为参考方法，GOD-POD 法只能 用作临床常规检测方法，评价方法和比较方法以及相应的试剂盒组成见本章后附录。 实验 27 线性范围试验 在光谱分析中，测定该实验条件下被测物质符合 Beer 定律的浓度范围(线性范围)，是评 价分析方法准确性和实用性的重要工作。通过线性范围测定，选择线性段作为该方法的分析 范围，直线上任何一点的待测物浓度与吸光度的比值均为一常数，其斜率 tanθ都相等，即 tanθ= K C A C A C A C A n n = = == = 3 3 2 2 1 1 ， 此处的值 K 称为校正常数，可用于计算测定结果。这样，可使具有临床意义的标本测定
值都限定在此范围内，以保证测定结果的可靠。线性误差表现为溶液的浓度与吸光度不成线性关系，出现正偏离或负偏离的现象。这种偏离，按Beer定律现象来自两个方面：一是溶液本身不符合Beer定律，这种现象叫做化学偏离；二是仪器本身各种因素的影响，使吸光度与浓度之间不成线性，这种现象叫仪器偏离如杂光、有限带宽、检测器噪声、环境条件的变化、波长的变动、比色杯的误差、辐射光的非平行性、检测器本身的非线性等。因此，在做方法学线性范围评价实验时，良好的仪器性能是必须的。【原理】使用不同浓度的葡萄糖标准溶液，用GOD-POD法试剂测定各自的吸光度，以标准浓度为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标，在方格纸上作图，即可绘制出一条直线，即剂量反应曲线(dose-respones curve)。一般测定方法的线性范围要求能覆盖临床上的参考值和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀释重测的机会。【试剂】1.40mmol/L葡萄糖标准溶液称取已干燥恒重的无水葡萄糖0.7208g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100ml。2h后方可应用。2.其它试剂同GOD-POD法试剂。【操作步骤】按表6-1操作表 6-1 血糖与 GOD-POD 试剂剂量反应曲线的制作标准管加入物012345葡萄糖标准液(μ)2460086蒸馏水(μl)1084201.51.5GOD-POD 试剂(ml)1.51.51.51.5下同GOD-POD法，读取各管吸光度以葡萄糖浓度(mmol/L)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，将其交点在方格纸上标出，即可获得血糖与 GOD-POD 试剂的剂量反应曲线。【注意事项】葡葡糖标准液的加量必须十分准确，应用计量性能准确度很高的微量进样器加样。.2．标准管系列中每管平行作3管取平均值
2 值都限定在此范围内，以保证测定结果的可靠。 线性误差表现为溶液的浓度与吸光度不成线性关系，出现正偏离或负偏离的现象。这种 偏离，按 Beer 定律现象来自两个方面：一是溶液本身不符合 Beer 定律，这种现象叫做化学 偏离；二是仪器本身各种因素的影响，使吸光度与浓度之间不成线性，这种现象叫仪器偏离， 如杂光、有限带宽、检测器噪声、环境条件的变化、波长的变动、比色杯的误差、辐射光的 非平行性、检测器本身的非线性等。因此，在做方法学线性范围评价实验时，良好的仪器性 能是必须的。 【原理】 使用不同浓度的葡萄糖标准溶液，用 GOD-POD 法试剂测定各自的吸光度， 以标准浓度为横坐标，以其对应的吸光度为纵坐标，在方格纸上作图，即可绘制出一条直线， 即剂量反应曲线(dose-respones curve)。一般测定方法的线性范围要求能覆盖临床上的参考值 和常见疾病的医学决定水平，以减少标本稀释重测的机会。 【试剂】 1．40mmol/L 葡萄糖标准溶液 称取已干燥恒重的无水葡萄糖 0.7208g，溶于 12mmol/L 苯甲酸溶液约 70ml 中，以 12mmol/L 苯甲酸溶液定容至 100ml。2h 后方可应用。 2．其它试剂 同 GOD-POD 法试剂。 【操作步骤】 按表 6-1 操作 表 6-1 血糖与 GOD-POD 试剂剂量反应曲线的制作 加入物 标 准 管 0 1 2 3 4 5 葡萄糖标准液(μl) 0 2 4 6 8 10 蒸馏水(μl) 10 8 6 4 2 0 GOD-POD 试剂(ml) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 下同 GOD-POD 法，读取各管吸光度。 以葡萄糖浓度(mmol/L)为横坐标，以对应的吸光度为纵坐标，将其交点在方格纸上标出， 即可获得血糖与 GOD-POD 试剂的剂量反应曲线。 【注意事项】 1．葡葡糖标准液的加量必须十分准确，应用计量性能准确度很高的微量进样器加样。 2．标准管系列中每管平行作 3 管取平均值
3．本方法的线性可达22.24mmol/L，造成线性变窄的原因为试剂配制中组分投料不足试剂配制后组分稳定性差；因运输、贮存不当等导致试剂组分的含量发生变化。4.有的测定特别是酶法测定，当酶量相对不足时，用标准液所作的线性范围可以达到指定的高限，但在测定同样高值样品时，结果却明显偏低，这往往是样品中的介质效应引起的，值得注意。【线性范围的确定及其评价】1.测定上限测定上限应使95%的临床标本不经稀释即可进行测定，具体数值必须通过线性范围试验加以确定，因为检测上限是不可超越的界限，当测定值高于上限临界值时，应减少标本用量或将标本稀释后重新测定。2.测定下限测定下限实测多少就报告多少，如未经验证，随意延长测定下限的做法是不正确的。3.对测定范围线性的评价通过制作剂量反应曲线的实验可以确定某种测定方法的吸光度一浓度线性范围，就能为制作实际工作中使用的校正曲线打下坚实的基础。随后要对其线性拟合的良好程度和实用性进行实际检查与评价。(1）对线性范围内的浓度与对应吸光度值作直线回归分析,求出此直线的截距a和斜率b，建立直线回归方程y=a+bx；并作相关分析，求出相关系数(r)。值得强调的是校正曲线是一条直线，回归一相关分析只是一种数据评价手段，不能代替在基本操作上下功夫。(2）线性回归方程拟合程度的检验：所绘制的回归直线能否代表原资料各观测点的趋势即各观测点与回归直线的差异是否只是来自随机抽样误差而无真正的差别，通过线性回归方程拟合度检验，即可作出判断。方法仍然是用变异分析，看剩余平方和的大小，如剩余平方和（L剩余)对总变异(（Lr)的比值越小，说明Y的实际观测值与Y的估计值（)越接近，曲线拟合越好。这种拟合度，可用相关指数(R2)来表示。R越接近于1.0，表明拟合度越高。_L剩余R2 =1-LyyL剩余 =2(Y-Y)?Lv =(Y - Y)?这里要注意的是L剩余必须由配得的回归方程直接算出的值计算。(3）使用高浓度和低浓度临床标本若干份进行实际的线性检查，理想的情况是该方法的分析范围的最高浓度上限应能使95%的临床标本不经稀释均能得到正确的测定结果
3 3．本方法的线性可达 22.24mmol/L，造成线性变窄的原因为试剂配制中组分投料不足； 试剂配制后组分稳定性差；因运输、贮存不当等导致试剂组分的含量发生变化。 4．有的测定特别是酶法测定，当酶量相对不足时，用标准液所作的线性范围可以达到指 定的高限，但在测定同样高值样品时，结果却明显偏低，这往往是样品中的介质效应引起的， 值得注意。 【线性范围的确定及其评价】 1．测定上限 测定上限应使 95%的临床标本不经稀释即可进行测定，具体数值必须通过 线性范围试验加以确定，因为检测上限是不可超越的界限，当测定值高于上限临界值时，应 减少标本用量或将标本稀释后重新测定。 2．测定下限 测定下限实测多少就报告多少，如未经验证，随意延长测定下限的做法是 不正确的。 3．对测定范围线性的评价 通过制作剂量反应曲线的实验可以确定某种测定方法的吸光 度－浓度线性范围，就能为制作实际工作中使用的校正曲线打下坚实的基础。随后要对其线 性拟合的良好程度和实用性进行实际检查与评价。 (1) 对线性范围内的浓度与对应吸光度值作直线回归分析，求出此直线的截距 a 和斜率 b， 建立直线回归方程 y=a+bx；并作相关分析，求出相关系数(r)。值得强调的是校正曲线是一条 直线，回归－相关分析只是一种数据评价手段，不能代替在基本操作上下功夫。 (2) 线性回归方程拟合程度的检验：所绘制的回归直线能否代表原资料各观测点的趋势， 即各观测点与回归直线的差异是否只是来自随机抽样误差而无真正的差别，通过线性回归方 程拟合度检验，即可作出判断。方法仍然是用变异分析，看剩余平方和的大小，如剩余平方 和( L剩余 )对 Y ˆ 总变异( LYY )的比值越小，说明 Y 的实际观测值与 Y 的估计值( Y ˆ )越接近，曲线 拟合越好。这种拟合度，可用相关指数( 2 R )来表示。 2 R 越接近于 1.0，表明拟合度越高。 YY 2 剩余 L L R =1− 2 剩余 Y) L = Σ(Y − ˆ 2 YY L = Σ(Y − Y) 这里要注意的是 L剩余 必须由配得的回归方程直接算出的 Y ˆ 值计算。 (3) 使用高浓度和低浓度临床标本若干份进行实际的线性检查，理想的情况是该方法的分 析范围的最高浓度上限应能使 95%的临床标本不经稀释均能得到正确的测定结果
实验28批内重复性试验方法学重复性试验的目的是测定实验方法的偶然误差，但产生偶然误差的原因也可能由于仪器、温度、试剂、标准品缺乏稳定性，吸量、计时、混匀等操作缺乏重现性造成，应排除这些因素才能把试验所产生的误差归于方法学的误差。重复性试验依据时间间隔可分为批内、天内、天间三种重复性试验。方法学评价重复性试验应由实验者作批内(或天内）及天间重复性试验。考虑教学安排，本实验仅做批内重复性试验，【原理】批内重复性试验是指在相同条件下(用同样的方法，同一种试剂和标准品，同一台仪器，在同一实验室由同一人操作，并保持实验期间准确度不变)对同一标本在尽可能短的时间内进行m轮，每轮n次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。其结果能反映各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价GOD-POD法测血糖随机误差的大小。【试剂】1.标本采用血糖浓度约为6.7mmol/L的血清标本(收集无溶血、无脂浊、无肝炎病毒污染的人混合血清或动物血清)。2 其它试剂同血糖测定评价方法(GOD-POD)。【操作步骤】将血清标本用GOD-POD法作5轮，每轮4次血糖测定，即可获得20个测定数据。【计算】1.检验20次测定数据中的离群值如存在异常值时应剔除。对小样本测定来讲，Grubbs检验方法概率意义明确，能给出严格的结果，是最合理的检验方法。用Grubbs 检验准则，检验离群值的统计学公式是：[xd-X [G=式中Xd为离群值；x为包括离群值在内的测定值的均数；S为包括离群值在内的测定值的标准差。如果计算的G值大于系数表(表 6-2)中相应显著水平的a和测定次数n 时的临界值 Ga.n,则将dx作为异常值弃舍，可按下述三种情况来处理(1）只有一个离群值的情况：设有n个测定数(Xi<X2<X<X<<X),其中Xi为离群值即可利用上述公式，直接对XI进行检验
4 实验 28 批内重复性试验 方法学重复性试验的目的是测定实验方法的偶然误差，但产生偶然误差的原因也可能由 于仪器、温度、试剂、标准品缺乏稳定性，吸量、计时、混匀等操作缺乏重现性造成，应排 除这些因素才能把试验所产生的误差归于方法学的误差。 重复性试验依据时间间隔可分为批内、天内、天间三种重复性试验。方法学评价重复性 试验应由实验者作批内(或天内) 及天间重复性试验。考虑教学安排，本实验仅做批内重复性 试验。 【原理】 批内重复性试验是指在相同条件下(用同样的方法，同一种试剂和标准品，同 一台仪器，在同一实验室由同一人操作，并保持实验期间准确度不变)对同一标本在尽可能短 的时间内进行 m 轮，每轮 n 次重复测定，以获得批内精密度数据的试验方法。其结果能反映 各次测定结果相互接近的程度，用于客观评价 GOD-POD 法测血糖随机误差的大小。 【试剂】 1．标本 采用血糖浓度约为 6.7mmol/L 的血清标本(收集无溶血、无脂浊、无肝炎病毒 污染的人混合血清或动物血清)。 2．其它试剂 同血糖测定评价方法(GOD-POD)。 【操作步骤】 将血清标本用 GOD-POD 法作 5 轮，每轮 4 次血糖测定，即可获得 20 个 测定数据。 【计算】 1．检验 20 次测定数据中的离群值 如存在异常值时应剔除。对小样本测定来讲，Grubbs 检验方法概率意义明确，能给出严格的结果，是最合理的检验方法。 用 Grubbs 检验准则，检验离群值的统计学公式是： G= S Xd − X 式中 Xd 为离群值； X 为包括离群值在内的测定值的均数；S 为包括离群值在内的测定值 的标准差。 如果计算的 G 值大于系数表(表 6-2)中相应显著水平的 a 和测定次数 n 时的临界值 Ga.n， 则将 dx 作为异常值弃舍，可按下述三种情况来处理： (1) 只有一个离群值的情况：设有 n 个测定数(X1<X2<X3<X4<.<Xn)，其中 X1 为离群值， 即可利用上述公式，直接对 X1 进行检验
(2）如果离群值是两个或两个以上，但都分布在均数又的同一侧，例如XI、X都是离群值，则首先检验最内侧的一个数据(X2)，即通过检验G2来决定X是否应该弃舍。如果X应该弃舍，XI自然应该弃舍。如果X不应舍去，则再检验XI，但在检验XI时，测定次数不应作为少了一次。(3）如果离群值有两个或两个以上，而且又分布于均数两侧，例如X和X,都同属于离群值，则分别检验XI和Xn，是否应该舍去。如有一个数据决定舍去，那么再检验另一个数据时测定次数应该作为减少一次来处理，而且此时应该选择99%的置信水平。2.按照批内精密度的计算公式计算5轮每轮4次测定值的平均数(x）、标准差(S)和变异系数(CV%)。(1)批内均数=鲜轮测定值均数之和(二)测定轮数(m)(2) 内标准(0- 式中S2为5轮各次测定值的方差，即：SP-2(X,-X)P= 批内标准差罗×100(3)变异系数(CV%)批内均数(冈)首先计算出每轮测定值的均数、标准差(S)及方差s2、S2、S3、S，并将数值填入表6-3内。再将5轮的s?总和代入公式即可算出批内标准差SWw。最后计算出变异系数(CV%)
5 (2) 如果离群值是两个或两个以上，但都分布在均数 X 的同一侧，例如 X1、X2 都是离群 值，则首先检验最内侧的一个数据(X2)，即通过检验 G2 来决定 X2 是否应该弃舍。如果 X2 应 该弃舍，X1 自然应该弃舍。如果 X2 不应舍去，则再检验 X1，但在检验 X1 时，测定次数不应 作为少了一次。 (3) 如果离群值有两个或两个以上，而且又分布于均数两侧，例如 X1 和 Xn 都同属于离群 值，则分别检验 X1 和 Xn，是否应该舍去。如有一个数据决定舍去，那么再检验另一个数据时， 测定次数应该作为减少一次来处理，而且此时应该选择 99%的置信水平。 2．按照批内精密度的计算公式计算 5 轮每轮 4 次测定值的平均数( X )、标准差(S)和变异 系数(CV%)。 (1)批内均数＝ ( ) (m) X 测定轮数 每轮测定值均数之和 (2) 批内标准差(Sw)= m Si 2 式中 Si 2 为 5 轮各次测定值的方差，即： Si 2= 1 ( ) 2 − − n Xi X (3)变异系数(CV%)＝ (X ) Sw 批内均数 批内标准差 ×100 首先计算出每轮测定值的均数、标准差(Si)及方差 1 2 S 、 2 2 S 、 2 3 S 、 2 4 S ，并将数值填入表 6-3 内。 再将 5 轮的 2 i S 总和代入公式即可算出批内标准差 Sw。 最后计算出变异系数(CV%)